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前言

臨床成功的ADCs的設(shè)計不僅取決于有效載荷的效力及其附著點、連接子的穩(wěn)定性和有效的藥物釋放,而且還取決于抗體和生物偶聯(lián)技術(shù)的選擇。在過去10年中,所有經(jīng)FDA批準(zhǔn)的ADC都是以ADC的異構(gòu)混合物的形式存在,單抗的不同位置上附著著不同數(shù)量的藥物。偶聯(lián)位點對ADC穩(wěn)定性及其藥代動力學(xué)具有顯著的影響,高DAR(藥物抗體比)常常導(dǎo)致血漿清除迅速,而低DAR的ADC則表現(xiàn)出的活性較弱。在ADC的藥物中,裸單抗的存在是一種有效的競爭抑制劑。因此,在過去十年中,人們開發(fā)了一大批新的偶聯(lián)策略,目的是控制小分子藥物的位置和數(shù)量,同時保持結(jié)構(gòu)完整性和同質(zhì)性。

基于化學(xué)的特異性原位抗體修飾

單克隆抗體的天然結(jié)構(gòu)為生物偶聯(lián)提供了多種可能性,基于化學(xué)的、特異性的天然(非工程)抗體偶聯(lián)具有一些優(yōu)點。它可以避免抗體特定位點突變的復(fù)雜性,以及在細(xì)胞培養(yǎng)的放大和優(yōu)化方面可能面臨的挑戰(zhàn)。

偶聯(lián)位點根據(jù)抗體序列,賴氨酸、組氨酸、酪氨酸和半胱氨酸等內(nèi)源性氨基酸在二硫鍵間的連接位點非常具有吸引力。所有經(jīng)FDA批準(zhǔn)的ADC,直到2021年,都利用這些內(nèi)源性氨基酸進(jìn)行偶聯(lián)。然而,抗體支架還包含聚糖,這是在單克隆抗體生產(chǎn)過程中,FC區(qū)域的翻譯后修飾所導(dǎo)致的。一些研究報告了糖工程化的新策略,這似乎是一種有趣的生物偶聯(lián)替代方法。

與內(nèi)源性氨基酸的偶聯(lián)

最常見的偶聯(lián)方法之一是利用抗體的賴氨酸殘基,氨基酸親核NH2基團(tuán)與利克有效載荷上親電的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)。盡管反應(yīng)簡單,但可利用賴氨酸殘基的高豐度導(dǎo)致了許多ADC在隨機(jī)分布下的不均勻混合物的形成。DAR受藥物/抗體化學(xué)計量比的控制,該方法得到廣泛應(yīng)用,包括已獲批的ADC,如Besponsa, Mylotarg, 和Kadcyla。

最近,同樣也報道了對賴氨酸位點和殘基的特異性修飾。通過計算機(jī)輔助設(shè)計,磺酰丙烯酸酯被用作中間試劑,用于在天然蛋白質(zhì)序列上對單個賴氨酸殘基進(jìn)行修飾。

反應(yīng)的區(qū)域選擇性歸咎于磺酰丙烯酸酯的設(shè)計以及每個賴氨酸周圍獨特的局部微環(huán)境。通過計算預(yù)測,pKa最低的賴氨酸容易以位點特異性的方式在弱堿性pH下優(yōu)先反應(yīng)。即使在其他親核殘基如半胱氨酸存在的情況下也觀察到了這種反應(yīng)。該技術(shù)已應(yīng)用于5種不同的蛋白質(zhì)和曲妥珠單抗,在偶聯(lián)后均保留了原有的二級結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)功能。

2018年,Rai等人報告了另一種利用“化學(xué)關(guān)鍵蛋白”的可逆分子間反應(yīng)進(jìn)行的位點特異性修飾。該試劑攜帶多種官能團(tuán),這些官能團(tuán)在所有可獲得的賴氨酸殘基上可逆地形成亞胺部分。然后,關(guān)鍵蛋白通過試劑中的環(huán)氧化物與近端組氨酸殘基反應(yīng)。因此,在生理條件下,關(guān)鍵蛋白從賴氨酸中分離,醛被再生,從而能夠通過肟結(jié)合標(biāo)記抗體。

這種關(guān)鍵蛋白的定向修飾技術(shù)后來發(fā)展成單賴氨酸殘基標(biāo)記技術(shù),即使在存在N-末端胺的情況下也具有毋庸置疑的選擇性。方法的成功依賴于Fk1-間隔子-Fk2試劑。

Fk1官能團(tuán)與賴氨酸可逆反應(yīng),調(diào)節(jié)Fk2近端賴氨酸部分的微環(huán)境。然后通過酰胺鍵在Fk2處的賴氨酸殘基(K169和K395)進(jìn)行偶聯(lián),間隔子的設(shè)計調(diào)節(jié)偶聯(lián)的位置。該方法已成功應(yīng)用于ADC(trastuzumab-emtansine)的合成,證明其細(xì)胞活性與已獲批準(zhǔn)的Kadcyla相當(dāng)。

Merlul等人最近報道了一種不同的結(jié)合策略,有效地靶向天然抗體上的組氨酸殘基。他們引入了一種基于陽離子有機(jī)金屬鉑(II)的連接子,[乙二胺鉑(II)]2+,圖中表示為Lx。

這種技術(shù)基于絡(luò)合和偶聯(lián)兩個步驟。氮雜環(huán)配體如哌啶與Lx配位形成絡(luò)合物前體,穩(wěn)定的中間體包含有效載荷和配體上的一個氯離子。該復(fù)合物含有帶正電荷的Pt(II)中心,這提高了連接子和有效載荷復(fù)合物的水溶性并最小化抗體聚集,該方法還擴(kuò)展到類似的碘絡(luò)合物。在最近的一份報告中,碘化鈉的使用被證明可以顯著提高該技術(shù)的偶聯(lián)產(chǎn)率和選擇性。Cl-Lx-藥物載荷絡(luò)合物上殘留的氯配基與碘化物的交換生成更具活性的I-Lx-藥物載荷,從而獲得更高的偶聯(lián)產(chǎn)率。這項技術(shù)已被應(yīng)用于ADC藥物的大規(guī)模生產(chǎn)。

二硫化物重橋接策略

IgG抗體包含四個鏈間二硫鍵,兩個連接輕鏈和重鏈,兩個位于連接兩條重鏈的鉸鏈區(qū),它們維持著單克隆抗體的完整性。另一個經(jīng)典的生物偶聯(lián)途徑探索了這些半胱氨酸作為有效載荷連接點的作用。四個二硫鍵的還原通常會產(chǎn)生八個巰基,它們能夠與馬來酰亞胺的連接子反應(yīng),從而產(chǎn)生DAR為8的ADC。

Doronina及其同事報告了嵌合抗CD30單克隆抗體偶聯(lián)MMAE,DAR=8的 ADC實例。與經(jīng)典的賴氨酸偶聯(lián)相比,這種有效載荷加載方式得到了更好的控制。然而,據(jù)報道,較高的藥物負(fù)荷會增加聚集的風(fēng)險,從而導(dǎo)致高血漿清除率,并降低體內(nèi)療效。

Badescu和al在2014年報告了一種新的位點特異性重橋接偶聯(lián)策略,他們是第一個證明新的雙砜(bis-sulfone)能夠烷基化來自抗體和抗體片段中還原二硫鍵的兩個巰基,對抗原結(jié)合的影響最小。后來,Wang和al描述了一種新的水溶性烯丙砜(allyl sulfone),該試劑在沒有原位活化的情況下提高了反應(yīng)活性。它表現(xiàn)出高穩(wěn)定性、高水溶性和位點特異性。

此外,還有巰基炔與末端炔烴和環(huán)辛炔生物偶聯(lián)的再橋接技術(shù),其進(jìn)一步發(fā)展出新一代馬來酰亞胺,如二溴-(DBM)和二硫代馬來酰亞胺(DTM),用于位點特異性偶聯(lián)。這些馬來酰亞胺類似物在第3位和第4位含有良好的脫離基團(tuán),從而實現(xiàn)快速、高效和高產(chǎn)率的偶聯(lián)。最近報道了結(jié)合二溴和二硫代馬來酰亞胺性質(zhì)的雜化硫代溴馬來酰亞胺(TBM),這種TBM試劑結(jié)合更快,顯示出更高的DAR=4的百分比,這可能是由于溴減少了空間位阻。

2015年,Chudasama等人引入了一類新的重橋接試劑,二溴吡啶二酮(dibromopyridazinediones)。他們證明了它能有效地插入到二硫鍵中,得到的結(jié)構(gòu)即使在高溫下也表現(xiàn)出了極好的水解穩(wěn)定性。然而,隨著還原步驟上的溫度升高,也觀察到不均一性,這種結(jié)構(gòu)也允許選擇性地引入不同的功能基團(tuán)。

二乙烯基嘧啶(Divinylpyrimidine)是另一種有效的重橋接試劑,能夠產(chǎn)生穩(wěn)定的DAR=4的ADC。Spring等人研究了乙烯基雜芳基支架對半胱氨酸再橋接的作用,他們認(rèn)為用嘧啶取代吡啶可以使雜芳環(huán)成為更好的電子受體,從而提高交聯(lián)效率。他們的工作擴(kuò)展到二乙烯基三嗪,在高溫下,重橋接顯示出更高的效率。

為了避免與經(jīng)典馬來酰亞胺偶聯(lián)相關(guān)的體內(nèi)不穩(wěn)定性的缺點,Barbas等人研究了甲基磺�；�苯基惡二唑,該試劑對半胱氨酸具有特異性反應(yīng)。與血漿中的半胱氨酸-馬來酰亞胺偶聯(lián)物相比,他們的穩(wěn)定性更高。受此啟發(fā),Zeglis設(shè)計了DiPODS試劑,該試劑含有兩個通過苯基連接的惡二唑基甲基砜部分, DiPODS以重橋接的方式與兩個硫酸根形成共價鍵。與馬來酰亞胺偶聯(lián)相比,以這種方式偶聯(lián)具有優(yōu)越的體外穩(wěn)定性和體內(nèi)性能。

聚糖偶聯(lián)

由于IgG是一種糖蛋白,它在Fc片段每個重鏈的CH2結(jié)構(gòu)域N297位置包含一個N-聚糖,這種糖基化可以作為連接有效載荷的附著點。多糖與Fab區(qū)域間遠(yuǎn)距離定位降低了在偶聯(lián)后損害抗體的抗原結(jié)合能力的風(fēng)險,此外,與抗體的肽鏈相比,它們的化學(xué)組成不同,允許位點特異性修飾,使它們成為合適的偶聯(lián)位點。

聚糖生物偶聯(lián)可根據(jù)用于靶向碳水化合物的技術(shù)來區(qū)分:包括聚糖代謝工程化、聚糖氧化后的糖轉(zhuǎn)移酶處理、內(nèi)糖苷酶和轉(zhuǎn)移酶處理后的酮或疊氮化物標(biāo)記。

Neri等人報道了在IgG抗體的N-糖基化位點處巖藻糖的位點特異性修飾。這種糖含有一個順式二醇部分,適合選擇性氧化。他們用偏高碘酸鈉氧化巖藻糖殘基,生成一個能夠與含聯(lián)氨的連接子反應(yīng)的醛基,這樣,抗體通過腙鍵與藥物相連。

Senter及其同事向細(xì)胞培養(yǎng)基中添加硫基類似物,通過代謝將6-硫代巖藻糖帶入抗體修飾。他們認(rèn)為,取代是通過劫持巖藻糖基化途徑來完成的,這樣就引入了化學(xué)位點來實現(xiàn)位點特異性結(jié)合。與經(jīng)典半胱氨酸偶聯(lián)物相比,這種方法顯著降低了異質(zhì)性水平,并產(chǎn)生具有更可預(yù)測的藥動學(xué)和藥效學(xué)特性的偶聯(lián)物。

重組IgG中很少含有唾液酸,然而,已經(jīng)證明,利用半乳糖基和唾液酸轉(zhuǎn)移酶可以酶法改造甘氨酸。通過酶反應(yīng)添加半乳糖以獲得G2聚糖,然后添加末端唾液酸。這種修飾通過高碘酸氧化生成醛基,可以偶聯(lián)帶羥胺基團(tuán)的連接子-有效載荷。所得的偶聯(lián)物具有較高的靶向選擇性,體內(nèi)抗腫瘤活性良好。高碘酸還可氧化蛋氨酸等敏感氨基酸,影響與FcRn的結(jié)合。

除這些偶聯(lián)策略外,半乳糖殘基也可以作為修飾位點。多項研究報告了通過使用突變的β- 1,4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶,將半乳糖替換為一種含酮或疊氮官能團(tuán)的半乳糖,這種具有雙正交官能團(tuán)的半乳糖衍生物為高效偶聯(lián)開辟了途徑。這些技術(shù)已被開發(fā)用于成像和抗癌應(yīng)用。

從化膿性鏈球菌中發(fā)現(xiàn)的內(nèi)糖苷酶EndoS和EndoS2,這些酶能夠水解IgG的N-聚糖,從而使水解后的殘基成為生物偶聯(lián)的有效位點。這種方法有助于使單抗的聚糖結(jié)構(gòu)均勻化,同時它也適用于任何IgG亞型。此類方法應(yīng)用于trastuzumab-maytansine,制備出具有良好體外和體內(nèi)藥效的糖偶聯(lián)ADC。

工程化抗體的位點特異性生物偶聯(lián)

生物正交化學(xué)和蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域的進(jìn)展有助于產(chǎn)生更均勻的ADC。盡管在天然單抗上有許多可用的附著方法可供選擇,但在工程化抗體上的位點特異性生物偶聯(lián)能夠更有效地控制DAR,并且避免改變與抗原結(jié)合的親和力。這樣,在某些位置加入天然或非天然氨基酸,得到具有優(yōu)良藥代動力學(xué)和藥效學(xué)特征的同質(zhì)產(chǎn)品。

酶法

有效載荷的附著可以通過在抗體序列中插入特定的氨基酸標(biāo)簽以非常有選擇性的方式實現(xiàn)。這些標(biāo)簽被特定的酶所識別,例如甲酰甘氨酸生成酶(FGE)、微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(MTG)、轉(zhuǎn)肽酶或酪氨酸酶,從而能夠執(zhí)行位點特異性偶聯(lián)。

Aaron等人探索了一種新的利用醛標(biāo)記蛋白質(zhì)的位點特異性偶聯(lián)。該技術(shù)利用了基因編碼的五肽序列(Cys-X-Pro-X-Arg),其中半胱氨酸殘基被FGE識別,并在細(xì)胞中蛋白質(zhì)表達(dá)期間被共翻譯氧化為甲酰甘氨酸。這樣,工程化抗體通過HIPS(hydrazino-Pictet–Spengler)化學(xué)方法與醛特異性連接子選擇性偶聯(lián)。

微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(MTGase)策略也經(jīng)常被開發(fā)用于定位特異性偶聯(lián)。MTGase催化在脫糖抗體295位置的谷氨酰胺側(cè)鏈與底物的伯胺之間形成肽鍵。與其他酶策略相比,MTG是一種靈活的技術(shù),不需要肽供體來實現(xiàn)偶聯(lián)。只要�；�受體含有一種伯胺,就沒有結(jié)構(gòu)限制。

谷氨酰胺殘基自然存在于單抗的每個重鏈的Fc區(qū)域。在295位去糖基化后,谷氨酰胺殘基通過MTGase介導(dǎo)的反應(yīng)偶聯(lián),可以產(chǎn)生均一的DAR=2的ADC。為了提高效率,可以偶聯(lián)帶支鏈的連接子,從而使DAR翻倍,297位的天冬酰胺突變?yōu)楣劝滨０芬部稍黾覦AR。

NBE Therapeutics開發(fā)了基于S金黃色葡萄球菌轉(zhuǎn)肽酶A介導(dǎo)的偶聯(lián)。他們的策略利用轉(zhuǎn)肽酶A(SrtA),在LPXTG(X=任何氨基酸)五肽的基序中切割蘇氨酸和甘氨酸殘基之間的酰胺鍵。然后,它催化甘氨酸相關(guān)的有效載荷與新生成的C-末端的偶聯(lián),在生理溫度和pH下生成肽鍵。

該方法應(yīng)用于不同抗體,如抗CD30和抗Her2,并使用含有5甘氨酸標(biāo)記的連接子偶聯(lián)maytansine和MMAE,兩種ADC均顯示出與經(jīng)典偶聯(lián)相似的體外細(xì)胞殺傷活性。酶法產(chǎn)生的trastuzumab-maytansine在體內(nèi)試驗中完全匹配Kadcyla。

在另一個例子中,利用轉(zhuǎn)肽酶法生成了高效蒽環(huán)素毒素衍生物PNU-159682的ADC。有趣的是,通過這項技術(shù),偶聯(lián)效率甚至高于Adcetris和Kadcyla類似物。此外,所制備的PNU-159682 ADC具有較高的體外和體內(nèi)穩(wěn)定性,并且顯示出的效力超過了含有微管蛋白靶向有效載荷的ADC。

另一個新興的新方法是通過酪氨酸標(biāo)簽進(jìn)行位點特異性抗體標(biāo)記,酪氨酸標(biāo)簽與單克隆抗體輕鏈的C末端基因融合�？紤]到位點可及性,Bruins及其同事使用了一種工程化的四甘氨酰酪氨酸殘基作為標(biāo)記,它為偶聯(lián)提供了一個容易觸及的位點。酪氨酸酶將酪氨酸氧化成1,2-醌,從而允許與各種雙環(huán)[6．1．0]壬炔(BCN)衍生物的環(huán)加成反應(yīng)。這種方法可以與含有BCN連接子的MMAE有效地偶聯(lián)。

半胱氨酸工程:硫單抗技術(shù)

隨機(jī)半胱氨酸偶聯(lián)和重橋接是利用抗體結(jié)構(gòu)內(nèi)天然存在的半胱氨酸殘基的技術(shù)。然而,隨機(jī)半胱氨酸方法的異質(zhì)性以及重橋接策略中的單抗片段化需要在ADC合成中加以考慮,特別是當(dāng)疏水性藥物被偶聯(lián)時。

與它們不同的是,硫單抗技術(shù)通過利用不涉及結(jié)構(gòu)二硫鍵的工程化反應(yīng)性半胱氨酸,在抗體上實現(xiàn)所需位點的選擇性和均勻修飾。一般來說,半胱氨酸突變的設(shè)計是為了促進(jìn)細(xì)胞毒性有效載荷偶聯(lián)的同時,保持單克隆抗體的穩(wěn)定性、親和力和最小化ADC聚集。為了確定突變的最佳位置,通常采用幾種技術(shù),包括計算建模、模型系統(tǒng)篩選和高通量掃描。

Junutula等人首先報道了一種硫單抗策略,用工程化半胱氨酸殘基取代了抗MUC16抗體重鏈114位的丙氨酸(HC-A114),工程化位置內(nèi)的反應(yīng)性硫醇能夠與馬來酰亞胺負(fù)載的連接子反應(yīng)。合成的抗MUC16 ADC在異種移植小鼠模型中表現(xiàn)出效力,在大鼠和食蟹猴中表現(xiàn)出高劑量耐受性,這個發(fā)現(xiàn)建立了硫單抗偶聯(lián)策略的一般性方法。

此外,琥珀酰亞胺連接在胞漿內(nèi)可以經(jīng)歷兩個平行反應(yīng):反向Michael反應(yīng)導(dǎo)致連接子-有效載荷的損失,以及琥珀酰亞胺的水解,這兩種反應(yīng)都對體內(nèi)ADC活性有顯著影響。為了提高穩(wěn)定性,Lyon和合作者設(shè)計了一個與馬來酰亞胺相鄰的堿性氨基整合進(jìn)來的連接子。在連接子中加入二氨基丙酸(DPR)促進(jìn)了硫琥珀酰亞胺在中性pH和室溫下的快速定量水解,這樣,非特異性的去偶聯(lián)作用被阻止,從而提高了體內(nèi)的穩(wěn)定性。除了常用的馬來酰亞胺外,還探索了不同的半胱氨酸反應(yīng)劑,如碘乙酰胺、溴甲酰胺、羰基丙烯酸酯,N-烷基乙烯基吡啶鹽。

與工程化非天然氨基酸的生物偶聯(lián)

除了硫單抗技術(shù)外,非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸(ncAA)的加入為位點特異性偶聯(lián)提供了另一種可能性。該技術(shù)使用含有獨特化學(xué)結(jié)構(gòu)的氨基酸,從而能夠以化學(xué)選擇性的方式引入連接子-有效載荷復(fù)合物。該技術(shù)需要對抗體序列重組,利用與宿主細(xì)胞內(nèi)所有內(nèi)源性tRNAs和合成酶正交的tRNA和氨基酰tRNA合成酶(aaRS),用于響應(yīng)未賦值密碼子將ncAA帶入蛋白質(zhì)。通常,ncAA在發(fā)酵過程中被添加到培養(yǎng)基中。選擇非天然氨基酸是很重要的,因為它們可能激發(fā)免疫原性。常用的ncAA是具有獨特基團(tuán)的天然氨基酸的類似物,如酮、疊氮、環(huán)丙烯或二烯。

已有研究將對乙酰苯丙氨酸(pAcF)成功地整合入抗CXCR4 抗體中。有效載荷Auristin通過肟連接與抗體有效偶聯(lián),從而生成化學(xué)均一的ADC。該ADC在小鼠體內(nèi)表現(xiàn)出良好的體外活性和完全清除肺腫瘤的作用。

由于肟連接所需的酸性條件和ADC緩慢釋放的動力學(xué),另一種選擇是加入含ncAA的疊氮化物。廣泛應(yīng)用的對疊氮哌苯胺(pAzF)可在生理條件下快速進(jìn)行CuAAC或SPAAC反應(yīng),利用這種策略成功地在抗CD74抗體上偶聯(lián)糖皮質(zhì)激素有效載荷。除了pAcF技術(shù)外,還成功地將含疊氮的賴氨酸類似物(AzK)帶入到抗體中,以產(chǎn)生具有Auristin、PBD二聚體或微管蛋白有效載荷的位點特異性ADC。

此外,賴氨酸的環(huán)丙烯衍生物(CypK)以及自然發(fā)生的非典型氨基酸,如硒代半胱氨酸(Sec)都成功地整合進(jìn)入抗體中。所產(chǎn)生的ADC表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性、選擇性以及體外和體內(nèi)活性。

ADC的臨床開發(fā)概況

目前,ADC藥物開發(fā)領(lǐng)域持續(xù)火熱,有效載荷,連接子和偶聯(lián)技術(shù)的快速發(fā)展使ADC具有更高的均勻性、穩(wěn)定性和生成效率。這為臨床上的ADC藥物開發(fā)提供了燃料,下面3個表格按照“小分子、生物大分子和放射性同位素”的分類總結(jié)了截至2021年2月處于臨床開發(fā)后期中的ADC。

小結(jié)

盡管第一個ADC在20多年前就獲得了FDA的首次批準(zhǔn),但制藥行業(yè)必須經(jīng)歷一個漫長且乏味的學(xué)習(xí)過程,才能在市場和臨床開發(fā)中獲得一條穩(wěn)定的ADC管線。得益于技術(shù)的進(jìn)步,我們在有效載荷,連接子和偶聯(lián)技術(shù)方面獲得了多個突破,進(jìn)一步加深了對ADC這種新型藥物的全面認(rèn)識,但是將這些知識如何轉(zhuǎn)化為更安全和更有效的ADC藥物,仍然有很多需要學(xué)習(xí)和探索的地方。希望最近的3篇總結(jié)能夠為大家提供一點點幫助。

參考文獻(xiàn):

1．The Chemistry Behind ADCs． Pharmaceuticals (Basel)． 2021 May; 14(5): 442．