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前言

疫苗是預(yù)防傳染性疾病傳播的最有效的公共衛(wèi)生干預(yù)措施。成功的疫苗接種根除了許多威脅生命的疾病,如天花和脊髓灰質(zhì)炎,世界衛(wèi)生組織估計(jì)疫苗每年可防止200-300萬人死于破傷風(fēng)、百日咳、流感和麻疹。然而,盡管常規(guī)疫苗取得了明顯的成功,但它們并不能有效對付瘧原蟲、丙型肝炎和HIV等逃避免疫監(jiān)視的病原體。此外,它們需要定期修改以應(yīng)對快速變異的病原體,如流感病毒。

基于mRNA的核酸疫苗是在30多年前提出的,希望能產(chǎn)生安全、多功能、易于生產(chǎn)的疫苗。mRNA疫苗比傳統(tǒng)疫苗有許多優(yōu)點(diǎn):與某些病毒疫苗不同,mRNA不會整合到基因組中,從而避免了對插入突變的擔(dān)憂;mRNA疫苗可以以無細(xì)胞的方式制造,從而實(shí)現(xiàn)快速、經(jīng)濟(jì)、高效的生產(chǎn)。此外,單個(gè)mRNA疫苗可以編碼多種抗原,增強(qiáng)針對適應(yīng)性病原體的免疫反應(yīng),并能夠以單一配方針對多種微生物或病毒變體。

最初,由于擔(dān)心其穩(wěn)定性、低效性和過度免疫刺激,mRNA治療并沒有得到重視。然而在過去的十年中,mRNA治療領(lǐng)域日新月異,包括mRNA藥理學(xué)的深入研究,有效載體的開發(fā)和mRNA免疫原性的控制,使得mRNA疫苗的臨床應(yīng)用進(jìn)入了一個(gè)嶄新的階段。

mRNA的設(shè)計(jì)與合成

體外轉(zhuǎn)錄(IVT)mRNA模擬內(nèi)源性mRNA的結(jié)構(gòu),有五個(gè)部分,從5?到3?包括:5?cap,5?非翻譯區(qū)(UTR),一個(gè)編碼抗原的開放閱讀框,3?UTR和一個(gè)PolyA尾。

與天然真核mRNAs一樣,5′端帽結(jié)構(gòu)包含一個(gè)7-甲基鳥苷核苷,5′端結(jié)構(gòu)會在空間上保護(hù)mRNA不被核酸外切酶降解,并與翻譯起始因子蛋白協(xié)同工作,招募核糖體以啟動翻譯。PolyA尾的長度間接調(diào)節(jié)mRNA翻譯和半衰期。

編碼區(qū)兩側(cè)的5′和3′UTR調(diào)節(jié)mRNA翻譯、半衰期和亞細(xì)胞定位,來自高表達(dá)基因(如α-和β-珠蛋白基因)的天然UTR是合成mRNAs的首選。此外,UTR可根據(jù)細(xì)胞類型進(jìn)行優(yōu)化,如通過去除3′UTR中的miRNA結(jié)合位點(diǎn)和富含AU的區(qū)域,將mRNA降解降至最低。

mRNA疫苗的開放閱讀框是最關(guān)鍵的組成部分,盡管開放閱讀框不像非編碼區(qū)那樣具有可塑性,但可以通過優(yōu)化密碼子,從而在不改變蛋白質(zhì)序列的情況下增加翻譯。例如,CureVac AG公司發(fā)現(xiàn)人類mRNA密碼子很少在第三位有A或U,從而用G或C替換開放閱讀框第三位的A或U。并將此優(yōu)化策略用于其SARS-CoV-2疫苗CVnCoV,目前正處于III期試驗(yàn)階段。

為了最大化翻譯,mRNA序列通常包含修飾的核苷,例如假尿苷、N1-甲基假尿苷或其他核苷類似物。修飾核苷的使用,特別是修飾尿苷,阻止了模式識別受體的識別,保證了翻譯過程產(chǎn)生足夠水平的蛋白質(zhì)。Moderna和Pfizer–BioNTech SARS-CoV-2疫苗都含有核苷修飾。另一種避免模式識別受體檢測的策略,由CureVac首創(chuàng),使用序列工程化和密碼子優(yōu)化,通過提高疫苗mRNA的GC含量來消耗尿苷。

除了mRNA序列的改進(jìn)外,在簡化mRNA生產(chǎn)方面也取得了重大進(jìn)展。臨床上使用的合成mRNA通過使用噬菌體RNA聚合酶T7(也可以使用T3和SP6聚合酶)從DNA質(zhì)粒在體外轉(zhuǎn)錄。另外,使用CleanCap的共轉(zhuǎn)錄封蓋技術(shù),簡化了純化步驟。

mRNA疫苗的載體

由于mRNA較大(104–106Da)且?guī)ж?fù)電,因此無法通過細(xì)胞膜的陰離子脂質(zhì)雙層。此外,在體內(nèi),它會被先天免疫系統(tǒng)的細(xì)胞吞噬,并被核酸酶降解。因此,體內(nèi)應(yīng)用需要使用mRNA遞送載體,該載體轉(zhuǎn)染免疫細(xì)胞而不會引起毒性或不必要的免疫原性。目前,已經(jīng)為此開發(fā)了許多基于創(chuàng)新材料的解決方案。

脂質(zhì)納米顆粒(LNP)

脂質(zhì)納米顆粒是臨床上最先進(jìn)的mRNA載體。截至2021年6月,所有正在研制或批準(zhǔn)臨床使用的SARS-CoV-2 mRNA疫苗均采用LNPs。LNP為mRNA遞送提供了許多好處,包括制劑簡單、模塊化、生物相容性和較大的mRNA有效載荷容量。除RNA藥物外,LNP通常包括四種成分,可電離脂質(zhì)、膽固醇、輔助磷脂和聚乙二醇化脂質(zhì),它們共同封裝和保護(hù)脆弱的mRNA。

可電離脂質(zhì)與mRNA在酸性緩沖液中形成納米顆粒,使脂質(zhì)帶正電荷并吸引RNA。此外,它們在內(nèi)涵體的酸性環(huán)境中帶正電荷,這促進(jìn)了它們與內(nèi)涵體膜的融合,將其釋放到細(xì)胞質(zhì)中。

DODAP和DODMA是第一種用于RNA輸送的可電離脂質(zhì)。通過設(shè)計(jì)提高DODMA的功效,產(chǎn)生了DLin-MC3-DMA。這是第一個(gè)FDA批準(zhǔn)的藥物制劑中使用的可電離脂質(zhì):siRNA藥物patisiran(Onpattro)。除了有效且安全地遞送siRNA外,DLin-MC3-DMA還用于mRNA的遞送。

目前,學(xué)術(shù)界和工業(yè)界的許多團(tuán)體使用組合反應(yīng)方案來合成潛在的傳遞材料,這種方法產(chǎn)生了許多有效的脂質(zhì),包括C12-200、503O13、306Oi10、OF-02、TT3、5A2-SC8、SM-102(用于抗SARS-CoV-2的Moderna疫苗mRNA-1273)和ALC-0315(用于輝瑞疫苗BNT162b2)。

除了尋求提高療效外,人們越來越關(guān)注提高藥物的特異性,特別是對疫苗和免疫療法的特異性。含有多環(huán)金剛烷尾的脂質(zhì)11-A-M58,和含有環(huán)咪唑頭的脂質(zhì)93-O17S59,已被設(shè)計(jì)用于體內(nèi)靶向T細(xì)胞。盡管機(jī)制尚不清楚,但這些脂質(zhì)的環(huán)狀基團(tuán)對于靶向T細(xì)胞至關(guān)重要。

盡管電離脂質(zhì)可以說是LNP最重要的成分,但其他三種脂質(zhì)成分(膽固醇、輔助脂質(zhì)和聚乙二醇化脂質(zhì))也促進(jìn)了納米粒子的形成和功能。膽固醇是一種天然存在的脂質(zhì),它通過填充脂質(zhì)之間的空隙來增強(qiáng)納米顆粒的穩(wěn)定性,并有助于在攝取到細(xì)胞的過程中與內(nèi)涵體膜融合。

輔助脂質(zhì)通過促進(jìn)有助于膜與內(nèi)涵體融合的脂質(zhì)相變來調(diào)節(jié)納米顆粒的流動性并增強(qiáng)功效。最佳輔助脂質(zhì)的選擇取決于可電離脂質(zhì)材料和RNA載體。例如,對于類脂質(zhì)材料,飽和輔助脂質(zhì)(如DSPC)最適合傳遞短RNA(如siRNA),而不飽和脂質(zhì)(如DOPE)最適合傳遞mRNA 。DSPC已被用于FDA批準(zhǔn)的SARS-CoV-2疫苗mRNA-1273和BNT162b2中。

LNPs的聚乙二醇化脂質(zhì)成分由聚乙二醇(PEG)與錨定脂質(zhì)(如DMPE或DMG)結(jié)合而成。親水性PEG可以穩(wěn)定LNP,通過限制脂質(zhì)融合調(diào)節(jié)納米顆粒大小,并通過減少與巨噬細(xì)胞的非特異性相互作用增加納米顆粒半衰期。mRNA-1273和BNT162b2 SARS-CoV-2疫苗均含有聚乙二醇化脂質(zhì)。

聚合物和聚合物納米顆粒

盡管臨床進(jìn)展不如LNP,但聚合物具有與脂質(zhì)相似的優(yōu)勢,能夠有效傳遞mRNA。陽離子聚合物將核酸濃縮成具有不同形狀和大小的復(fù)合物,可通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。

聚乙烯亞胺是研究最廣泛的核酸傳遞聚合物。盡管其功效卓越,但由于其高電荷密度,其毒性限制了應(yīng)用。此外,已經(jīng)開發(fā)出幾種毒性較小的可生物降解聚合物。例如,聚(β-氨基酯)在mRNA傳遞方面表現(xiàn)出色,尤其是對肺。

最近開發(fā)出了一種新型的含脂聚合物,稱為電荷改變可釋放轉(zhuǎn)運(yùn)體(CARTs),它能有效地靶向T細(xì)胞,操縱T細(xì)胞是非常困難的,因此,CART 是一種極具吸引力的傳遞材料,在mRNA疫苗和基因治療領(lǐng)域具有巨大潛力。

其他遞送系統(tǒng)

除了脂質(zhì)和聚合物載體外,肽也可以將mRNA傳遞到細(xì)胞中,這要?dú)w功于其主鏈和側(cè)鏈中的陽離子或兩親胺基(例如精氨酸),這些陽離子或兩親胺基與mRNA靜電結(jié)合并形成納米復(fù)合物。例如,含有重復(fù)的精氨酸-丙氨酸-亮氨酸-丙氨酸(RALA)基序的膜融合細(xì)胞穿透肽。

富含精氨酸的魚精蛋白肽在中性pH下帶正電荷,也可以濃縮mRNA并促進(jìn)其傳遞。魚精蛋白與mRNA復(fù)合物激活識別單鏈mRNA的Toll樣受體(TLR7,TLR8)通路,因此,它還可以作為疫苗或免疫治療應(yīng)用的佐劑。CureVac AG正在評估一種含有魚精蛋白的遞送平臺RNActive,用于黑色素瘤、前列腺癌和非小細(xì)胞肺癌的臨床試驗(yàn)。

最后,基于角鯊烯陽離子納米乳液也可以傳遞mRNA,這些納米乳劑由油性角鯊烯核組成。一些角鯊烯制劑,如諾華的MF59,在FDA批準(zhǔn)的流感疫苗中用作佐劑。MF59使注射部位的細(xì)胞分泌趨化因子,從而招募抗原呈遞細(xì)胞,誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化為樹突狀細(xì)胞,并增強(qiáng)抗原呈遞細(xì)胞對抗原的攝取。角鯊烯基陽離子納米乳劑從內(nèi)涵體逃逸并將mRNA輸送到細(xì)胞質(zhì)中的機(jī)制尚不清楚。

mRNA疫苗技術(shù)創(chuàng)新

mRNA疫苗技術(shù)最重要的創(chuàng)新在于:mRNA 序列設(shè)計(jì);開發(fā)簡單、快速和大規(guī)模生產(chǎn) mRNA 的方法;開發(fā)高效、安全的 mRNA 疫苗遞送材料。

最近的一項(xiàng)研究使用了一種基于細(xì)胞培養(yǎng)的系統(tǒng)選擇過程來識別新的UTRs,它顯著增加了IVT mRNA的蛋白質(zhì)表達(dá)。與人類β-珠蛋白3’UTR的相比,這些序列可以誘導(dǎo)相關(guān)轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生大約3倍的蛋白質(zhì)。

此外,最近報(bào)道了一種有趣的新疫苗形式,該方法利用編碼α病毒RNA依賴性RNA聚合酶的mRNA加上編碼抗原的第二個(gè)mRNA,使其在細(xì)胞質(zhì)中能夠復(fù)制。這種系統(tǒng)可以在非常低的劑量(50ng)就有效地誘導(dǎo)小鼠的保護(hù)性免疫反應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)特別有吸引力,因?yàn)榈蛣┝康氖褂媒档土艘呙缟�產(chǎn)的成本。無遞送材料進(jìn)一步降低了成本,簡化了制造,并且提高了疫苗凍干和在環(huán)境溫度下儲存的可能性。

在生產(chǎn)方面,除了cleancap技術(shù)外,最近開發(fā)了一種通過將雙鏈RNA污染物吸附到纖維素(一種廉價(jià)且豐富的多糖)來純化mRNA的簡單方法。研究證明,這種高度可擴(kuò)展且廉價(jià)的方法與高效液相色譜法一樣有效地去除IVT mRNA樣本中的dsRNA污染物。

在遞送材料方面,與基于聚合物的CART平臺類似,mRNA-LNPs也實(shí)現(xiàn)了選擇性T細(xì)胞靶向。一種新的平臺,稱為ASSET(錨定二級靶向單鏈抗體),其中T細(xì)胞特異性單克隆抗體與LNP相連,以靶向T細(xì)胞。這種靈活的平臺在mRNA疫苗和其他應(yīng)用方面也有很大的潛力。

另外一種脂質(zhì)復(fù)合物在全身給藥后優(yōu)先靶向樹突狀細(xì)胞。用mRNA疫苗選擇性靶向DC以誘導(dǎo)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)是一個(gè)潛在的關(guān)鍵發(fā)現(xiàn),該平臺已經(jīng)在臨床試驗(yàn)中證明了其前景。

mRNA疫苗在感染性疾病的研究進(jìn)展

以mRNA為基礎(chǔ)的治療代表了一個(gè)相對新穎和高效的藥物類別。最近發(fā)表的幾項(xiàng)研究強(qiáng)調(diào)了mRNA疫苗在治療不同類型的惡性腫瘤和傳染病方面的潛在療效,這些疾病中傳統(tǒng)的疫苗策略不能引起保護(hù)性免疫反應(yīng)。

截至2019年底,15種針對傳染病的候選mRNA疫苗已進(jìn)入臨床試驗(yàn),當(dāng)時(shí),人們認(rèn)為mRNA疫苗至少還需要5-6年才能獲得監(jiān)管部門的批準(zhǔn)。但是,當(dāng)2020年初COVID-19大流行橫行世界時(shí),這些期望就被顛覆了。在接下來的幾個(gè)月里,mRNA疫苗的研發(fā)、制造和部署都進(jìn)入了飛速跨越的階段。

SARS-CoV-2疫苗

大多數(shù)SARS-CoV-2候選疫苗對病毒表面的棘突蛋白產(chǎn)生免疫反應(yīng)。棘突蛋白與其宿主細(xì)胞表面的受體血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2結(jié)合。然后,細(xì)胞的跨膜絲氨酸蛋白酶2將附著的棘突蛋白切開,該蛋白酶誘導(dǎo)構(gòu)象變化,暴露棘突蛋白的融合肽并促進(jìn)與細(xì)胞或內(nèi)體膜的融合。通常,疫苗mRNA編碼的抗原要么是全長棘突蛋白,要么是棘突蛋白的受體結(jié)合域。

截至2021年6月18日,185個(gè)CVID-19疫苗候選處于臨床前開發(fā)階段,另外102個(gè)已進(jìn)入臨床試驗(yàn)。在臨床試驗(yàn)中,19種為mRNA疫苗。2020年12月11日,輝瑞的BNT162b2疫苗獲得了FDA的緊急授權(quán),成為第一個(gè)獲準(zhǔn)用于人體的mRNA藥物。一周后,Moderna疫苗mRNA-1273也被授權(quán)在美國使用。最終,它們是第一批在美國、英國、加拿大和其他幾個(gè)國家獲得授權(quán)的SARS-CoV-2疫苗。

輝瑞和BioNTech共同開發(fā)了五種mRNA候選疫苗,它們編碼棘突蛋白抗原的變體。兩個(gè)主要候選藥物BNT162b1和BNT162b2使用Acuitas Therapeutics的可電離脂質(zhì)ALC-0315和核苷修飾的mRNA,其中所有尿苷被N1甲基假尿苷取代,以增強(qiáng)mRNA翻譯。BNT162b1編碼三聚體分泌型棘突蛋白的受體結(jié)合域,而BNT162b2編碼全長SARS-CoV-2棘突糖蛋白,S2亞基中有兩個(gè)脯氨酸替換,將蛋白鎖定在融合前構(gòu)象。

在兩種疫苗的第一階段試驗(yàn)中,都可誘導(dǎo)高滴度的中和抗體,并產(chǎn)生強(qiáng)烈的CD4+和CD8+反應(yīng),伴有輕度至中度不良反應(yīng)。兩種候選疫苗耐受性良好且有效,但只有BNT162b2疫苗因其較輕的全身和局部不良反應(yīng)而進(jìn)入II/III期試驗(yàn)。在第三階段試驗(yàn)中,BNT162B2顯示了95%的整體預(yù)防和90～100%的療效。

Moderna與國立衛(wèi)生研究院合作開發(fā)了mRNA-1273。該疫苗使用了可電離脂質(zhì)SM-102制備LNP,該LNP封裝N1甲基假尿苷修飾的mRNA。該序列編碼SARS-CoV-2棘突蛋白,帶有兩個(gè)脯氨酸替換,賦予融合前構(gòu)象。

在1期臨床試驗(yàn)中, mRNA-1273非常有效且耐受性良好。在涉及30420名志愿者的III期試驗(yàn)中,兩支100μg劑量疫苗的預(yù)防率為94．1%,注射部位的局部疼痛是最常見的副作用。第二次給藥后,一半的志愿者報(bào)告了中度至重度系統(tǒng)性副作用(例如疲勞、肌肉疼痛、關(guān)節(jié)疼痛),這些副作用在48小時(shí)內(nèi)消失。

盡管輝瑞和Moderna公司生產(chǎn)的疫苗已證明具有良好的療效和安全性,但它們對冷鏈儲存的需求帶來了保障的巨大困難。mRNA-1273可在4-8℃下儲存持續(xù)一個(gè)月,而BNT162b2則需要在-60℃條件下儲存。

CureVac的候選疫苗CVnCoV在5℃下可穩(wěn)定儲存3個(gè)月。CVnCoV使用Acuitas Therapeutics(可能是ALC-0315)的可電離脂質(zhì)和編碼具有兩個(gè)脯氨酸替代物的全長棘突蛋白的未修飾mRNA。在第一階段臨床試驗(yàn)中,志愿者產(chǎn)生的中和抗體與CVID-19恢復(fù)期患者相似,耐受性良好。然而不幸的是,在包括4萬人的III期臨床試驗(yàn)中,CVnCoV僅顯示出47%的療效。中期分析表明,CVnCoV的較低療效歸因于新出現(xiàn)的SARS-CoV-2變異。

目前,CureVac正與GSK合作,開發(fā)第二代候選藥物——CV2CoV,該藥物經(jīng)過優(yōu)化,以增強(qiáng)相對于CVnCoV的翻譯和免疫原性。CV2CoV使用來自人類羥基類固醇17-β-脫氫酶4基因的5′UTR和來自人類蛋白酶體20S亞單位β3基因的3′UTR。在臨床前研究中,CV2CoV在體外顯示出比CVnCoV高1．8倍的蛋白表達(dá),并在大鼠中誘導(dǎo)針對B．1．1．7、B．1．1．298和B．1．351變體的高滴度交叉中和抗體。

另一種耐熱候選疫苗ARCoV由中國人民解放軍軍事科學(xué)院與Walvax生物技術(shù)公司合作開發(fā),可以在25℃穩(wěn)定一周。ARCoV編碼棘突蛋白的受體結(jié)合域。在臨床前研究中,在食蟹猴中可誘導(dǎo)高SARS-CoV-2特異性IgG抗體和強(qiáng)病毒中和滴度。盡管CVnCoV和ARCoV熱穩(wěn)定性背后的原因尚不清楚,但mRNA二級結(jié)構(gòu)、較小的mRNA大小、GC含量和脂質(zhì)可能是重要因素。

其它一些mRNA候選疫苗也正在研制中。LNP-nCoVsaRNA由倫敦帝國理工學(xué)院和Acuitas Therapeutics合作開發(fā),編碼全長棘突蛋白。目前,正在使用0．1–1?g劑量遞增方案進(jìn)行I期臨床試驗(yàn)評估(ISRCTN17072692),其使用了所有候選mRNA疫苗中最低的RNA劑量。

另一種自擴(kuò)增mRNA疫苗候選物ARCT-021(也稱為LUNAR-COV19)由Arcturus公司利用其專有的LUNAR脂質(zhì)載體和自轉(zhuǎn)錄和復(fù)制RNA(STARR)平臺開發(fā)。它編碼全長融合前棘突蛋白。

流感病毒疫苗

全世界每年約有29萬至65萬人死于流感病毒。目前的疫苗以促進(jìn)病毒進(jìn)入的病毒血凝素蛋白為靶標(biāo)。傳統(tǒng)的流感疫苗是生長在雞蛋中的滅活流感病毒,生產(chǎn)時(shí)間長,純化困難。此外,病毒會在雞蛋中發(fā)生變異以獲得最佳生長,有時(shí)會使它們在人類中無效。

因此,確實(shí)需要替代的抗原靶點(diǎn)和生產(chǎn)方法。體外轉(zhuǎn)錄的合成mRNAs可以滿足這一需求,并確保在出現(xiàn)全新流感毒株時(shí)快速生產(chǎn)疫苗。例如,2013年,基于LNP(DLinDMA)的自我擴(kuò)增mRNA疫苗在中國H7N9爆發(fā)后8天內(nèi)迅速研制成功,然而不幸的是,由于當(dāng)時(shí)沒有用于mRNA制造的GMP設(shè)施,未能進(jìn)行臨床試驗(yàn)。

也有人致力于研制一種不需要每年修改的通用流感疫苗。這種疫苗可以對幾種流感病毒株和亞型產(chǎn)生免疫力。在2012年首次展示的流感mRNA疫苗,三次皮內(nèi)注射在小鼠中分別誘導(dǎo)針對H1N1和H5N1毒株的同源和異源免疫。

值得注意的是,不易發(fā)生突變的血凝素保守柄區(qū)最近已成為一種新型通用疫苗靶標(biāo)。還有另一項(xiàng)研究使用LNPs來遞送50ng劑量的mRNA,編碼三種保守的流感蛋白:神經(jīng)氨酸酶、核蛋白和基質(zhì)-2離子通道蛋白以及血凝素柄區(qū)。令人難以置信的是,這種微小的mRNA劑量產(chǎn)生了廣泛的保護(hù)性抗體。

寨卡病毒疫苗

寨卡病毒感染于1947年首次被發(fā)現(xiàn),感染寨卡病毒的患者通常無癥狀或出現(xiàn)發(fā)熱、皮疹和肌肉疼痛等輕微癥狀。然而,寨卡病毒在2015-2016年美洲流行期間成為全球健康危機(jī),該病毒在懷孕期間導(dǎo)致嚴(yán)重胎兒神經(jīng)畸形和胎兒死亡。膜和包膜蛋白(prM-E)是針對寨卡病毒的mRNA疫苗常見的抗原選擇,因?yàn)獒槍�prM-E的中和抗體可以防止病毒融合。

Moderna與華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院合作,開發(fā)了一種改良的prM-E mRNA,其中包含E蛋白中的突變?nèi)诤檄h(huán)形表位。兩個(gè)10?g劑量的mRNA可保護(hù)小鼠免受寨卡病毒攻擊,并減少登革熱增強(qiáng)抗體的產(chǎn)生。這些令人鼓舞的臨床前結(jié)果促進(jìn)了I期試驗(yàn)的進(jìn)行,中期結(jié)果表明,疫苗mRNA-1893在10天內(nèi)誘導(dǎo)94-100%的血清轉(zhuǎn)陽,耐受性良好。

此外,另一項(xiàng)研究使用被動免疫方法,利用基于角鯊烯的納米載體遞送編碼ZIKV中和抗體的mRNA。對于免疫系統(tǒng)受損而無法合成自身抗體的免疫缺陷患者來說,這是一種很有吸引力的方法。

HIV病毒疫苗

全球范圍內(nèi),艾滋病毒目前影響3800萬人,預(yù)計(jì)到2030年將影響多達(dá)4200萬人。盡管已進(jìn)行了30年的研究,但尚未開發(fā)出有效的疫苗,這主要是因?yàn)镠IV包膜蛋白具有顯著的抗原性多樣性以及隱藏關(guān)鍵包膜蛋白表位“聚糖屏障”。幾項(xiàng)臨床前研究已經(jīng)使用了多種載體,包括陽離子納米乳劑、DOTAP/DOPE脂質(zhì)體、Polymers和可電離LNP,它們在不同程度看到了一些效果。這些研究表明,除了有效的載體外,新的抗原對于有效地靶向HIV是非常關(guān)鍵的。

呼吸道合胞病毒疫苗

呼吸道合胞病毒是全球急性下呼吸道感染的主要原因。每年,估計(jì)有60000名5歲以下兒童死亡,超過14000名65歲以上的人死亡。

目前的RSV候選疫苗主要針對高度保守的F蛋白。盡管一些候選者由于中和抗體滴度不足而未能通過臨床試驗(yàn),但對F蛋白構(gòu)象的新發(fā)現(xiàn)表明,針對融合前構(gòu)象接種疫苗可產(chǎn)生優(yōu)異的中和抗體反應(yīng)。這一發(fā)現(xiàn)有望改進(jìn)未來的疫苗設(shè)計(jì)。

Moderna正在評估編碼融合前F蛋白的三種單劑量候選疫苗:mRNA-1172和mRNA-1777用于成人,以及mRNA-1345用于兒童。在I期臨床試驗(yàn)中,mRNA-1777誘導(dǎo)RSV中和抗體產(chǎn)生強(qiáng)烈的體液反應(yīng),CD4+T細(xì)胞對RSV F蛋白產(chǎn)生反應(yīng),且無嚴(yán)重不良事件。mRNA-1345的序列已被進(jìn)一步設(shè)計(jì)和密碼子優(yōu)化,以增強(qiáng)相對于mRNA-1777的翻譯和免疫原性。接種后1個(gè)月,mRNA-1345產(chǎn)生的中和抗體滴度約為mRNA-1777的八倍。最終,Moderna的目標(biāo)是將mRNA-1345與其兒科人類偏肺病毒/副流感病毒3型(hMPV/PIV3)候選疫苗mRNA-1653整合,并用單一配方為兒童接種針對三種不同病原體的疫苗。

埃博拉病毒疫苗

埃博拉病毒(EBOV)于1976年首次被確定為導(dǎo)致埃博拉病爆發(fā)的病原體。這種病毒性出血熱在2014-2016年西非埃博拉疫情中奪走了11000多條生命。2019年,FDA批準(zhǔn)了一種基于重組水泡性口炎病毒(VSV)的埃博拉疫苗(rVSV-EBOV)。盡管與未接種疫苗相比,rVSV-EBOV在預(yù)防埃博拉傳播方面的有效性為97．5%,但臨床試驗(yàn)注意到一些安全問題(例如急性關(guān)節(jié)炎和皮疹)。

抗EBOV的mRNA疫苗可能比這種基于病毒的疫苗更安全,因?yàn)樗鼈儾粫�在體內(nèi)復(fù)制。一種編碼EBOV糖蛋白的mRNA疫苗已在小鼠中證明了效力。該疫苗通過CD8+和CD4+T細(xì)胞誘導(dǎo)糖蛋白特異性IgG抗體和IFN-γ以及IL-2的強(qiáng)烈表達(dá),可保護(hù)動物免受致命病毒的傷害。

狂犬病毒疫苗

狂犬病是一種人畜共患病,以神經(jīng)癥狀為特征,死亡率近100%。盡管已有疫苗獲批,但每年仍有5萬多人死于狂犬病,這突出表明需要更有效、更廉價(jià)的疫苗。

為了滿足這一需求,CureVac利用其RNActive平臺,篩選出編碼狂犬病病毒糖蛋白的未經(jīng)修飾的mRNA疫苗CV7201。在一項(xiàng)臨床前研究中,CV7201可誘導(dǎo)小鼠和豬的高中和抗體滴度,并誘發(fā)抗原特異性CD4+和CD8+T細(xì)胞反應(yīng)。但是在I期臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),雖然給藥途徑不影響免疫反應(yīng),但給藥裝置只有皮內(nèi)注射器產(chǎn)生短暫的體液免疫反應(yīng)。這種弱的給藥效果以及高發(fā)生率的不良事件表明需要進(jìn)一步優(yōu)化給藥平臺。

隨后,CureVac使用Acuitas Therapeutics生產(chǎn)的專有LNP作為其新疫苗CV7202的載體。在一項(xiàng)臨床前研究中,CV7202誘導(dǎo)產(chǎn)生強(qiáng)抗體滴度和CD8+和CD4+T細(xì)胞反應(yīng)。I期臨床試驗(yàn)結(jié)果表明,兩個(gè)1?g劑量可產(chǎn)生高滴度中和抗體以及強(qiáng)適應(yīng)性免疫反應(yīng),耐受性良好。

瘧原蟲疫苗

盡管開發(fā)中的絕大多數(shù)mRNA疫苗是為了防止病毒感染,但也有預(yù)防其他傳染病的努力。瘧疾是由單細(xì)胞真核寄生蟲引起的,其發(fā)病率和殺傷力位居榜首。每年,瘧疾折磨著全世界2億多人,奪走40多萬患者的生命。由于缺乏表面抗原和瘧原蟲的復(fù)雜生命周期,抗瘧疫苗的生產(chǎn)一直很困難。幸運(yùn)的是,人體對瘧原蟲感染的自然免疫反應(yīng)的研究已經(jīng)確定了潛在的非表面抗原靶點(diǎn)。

例如,瘧原蟲分泌的細(xì)胞因子巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(PMIF)已被證明可阻止T細(xì)胞產(chǎn)生長期記憶。根據(jù)這一發(fā)現(xiàn),從基于角鯊烯的陽離子納米乳劑中制備了一種疫苗,該納米乳劑裝載有編碼PMIF的自擴(kuò)增mRNA。兩個(gè)15?g劑量可改善輔助性T細(xì)胞的發(fā)育,并誘發(fā)抗瘧原蟲IgG抗體和記憶性T細(xì)胞反應(yīng)。

另一項(xiàng)關(guān)于瘧疾感染的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),惡性瘧原蟲富含谷氨酸蛋白(PfGARP)是一種潛在的mRNA疫苗靶點(diǎn)。一種編碼PfGARP抗原的核苷修飾mRNA疫苗正在開發(fā)中,該疫苗使用了Acuitas Therapeutics專有的LNP。臨床前研究表明,該疫苗可以降低動物感染瘧原蟲后的反應(yīng)。

mRNA疫苗的關(guān)鍵問題

目前,針對mRNA疫苗的安全性人們還有很多疑惑。此外,mRNA疫苗也只有在SARS-CoV-2的預(yù)防中獲得批準(zhǔn),在其它方面的療效還有待進(jìn)一步研究。很多問題需要解決,下面我們來一起探討未來mRNA疫苗可能會面臨的一些關(guān)鍵問題。

抗原反應(yīng)持續(xù)時(shí)間

接種疫苗后,抗原被抗原呈遞細(xì)胞吸收并運(yùn)輸?shù)搅馨徒Y(jié),在淋巴結(jié)中,B細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞和濾泡輔助性T細(xì)胞(Tfh)之間的相互作用促進(jìn)生發(fā)中心的形成。在生發(fā)中心內(nèi),B細(xì)胞隨后增殖、分化并突變其抗體基因,以產(chǎn)生針對攻擊性抗原的高親和力中和抗體。生發(fā)中心反應(yīng)和Tfh細(xì)胞誘導(dǎo)對于持久的抗體反應(yīng)至關(guān)重要,這將保護(hù)患者數(shù)月或數(shù)年。

為了增強(qiáng)這一免疫反應(yīng)過程的第一步,一些傳遞系統(tǒng)以抗原呈遞細(xì)胞為靶點(diǎn),翻譯mRNA。積極靶向抗原呈遞細(xì)胞的幾種有希望的策略包括將單克隆抗體與LNP表面結(jié)合,并用樹突狀細(xì)胞特異性配體修飾LNP表面�；蛘�,調(diào)節(jié)LNP的物理性質(zhì),如表面電荷,已用于提高癌癥疫苗療效。

此外,通過延長抗原mRNA的翻譯來改變疫苗藥代動力學(xué)已成為增強(qiáng)抗體反應(yīng)的令人興奮的工具。生發(fā)中心反應(yīng)期間持續(xù)的抗原可用性已被證明可使抗體產(chǎn)生量增加約10倍。在小鼠中的一項(xiàng)研究表明,與未經(jīng)修飾的mRNA相比,核苷修飾的mRNA循環(huán)時(shí)間更長,并誘導(dǎo)更強(qiáng)的Tfh細(xì)胞和生發(fā)中心B細(xì)胞反應(yīng)。

在臨床試驗(yàn)中,兩次劑量的mRNA-1273也能在6個(gè)月內(nèi)引發(fā)持久的抗體反應(yīng)。盡管抗體滴度在研究期間略有下降,但所有年齡組均保持較高的中和能力。這些結(jié)果是有希望的,然而,抗體反應(yīng)的持續(xù)時(shí)間是一個(gè)復(fù)雜的現(xiàn)象,不同的抗原會有所不同,需要更長期的數(shù)據(jù)才能全面理解。

針對病毒的突變

病毒基因組的突變在復(fù)制過程中很常見。盡管大多數(shù)突變對病毒的功能影響很小或沒有影響,但一些突變可以增強(qiáng)免疫逃避,阻礙疫苗的開發(fā)。例如,30多年來,艾滋病毒的快速突變阻礙了有效疫苗的開發(fā),而流感病毒的突變需要每年對疫苗配方進(jìn)行修改,以針對優(yōu)勢毒株。

新出現(xiàn)的SARS-CoV-2變異也引起了對mRNA疫苗交叉變異效力的關(guān)注。B．1．351和P．1變體在棘突蛋白受體結(jié)合域的484位(E484K)存在谷氨酸(E)到賴氨酸(K)突變,這促進(jìn)了免疫逃避。幸運(yùn)的是,FDA批準(zhǔn)的mRNA疫苗BNT162b2和mRNA-1273產(chǎn)生了針對B．1．351和P．1以及其他變體的交叉中和抗體,這表明它們可以提供針對它們的保護(hù)。然而,與最先的病毒相比,交叉中和效應(yīng)已經(jīng)顯著降低。此外,在CureVac的候選CVnCoV的IIb/III期試驗(yàn)中,測序的124個(gè)COVID-19病例中有57%都是突變體,包括B．1．351和P．1變體。

如果這些變異毒株隨時(shí)間逐漸成為主要變異體,則可能需要變異體特異mRNA增強(qiáng)劑。目前,Moderna正在評估最初的mRNA-1273疫苗和作為第三劑增強(qiáng)劑的最新版疫苗:mRNA-1273．351,它編碼來自B．1．351變體的棘突蛋白,以及mRNA-1273．211,一種mRNA-1273和mRNA-1273．351的1:1的混合疫苗。

從長遠(yuǎn)來看,提供SARS-CoV-2和未來冠狀病毒爆發(fā)保護(hù)的泛冠狀病毒疫苗將會更有利。與HIV和流感一樣,新的結(jié)構(gòu)洞察有望促進(jìn)冠狀病毒保守位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn),加速抗原發(fā)現(xiàn)和疫苗設(shè)計(jì)。

安全性

總的來說,mRNA疫苗具有良好的安全性,臨床試驗(yàn)中僅發(fā)生輕度或中度不良事件。然而,也有個(gè)別事件要求進(jìn)一步優(yōu)化mRNA抗原和運(yùn)載工具組件。例如,CureVac基于魚精蛋白的狂犬病候選藥物CV7201在78%的參與者中引發(fā)嚴(yán)重不良事件,促使CureVac采用LNPs作為其后續(xù)狂犬病候選藥物CV7202的首選給藥平臺。

與大多數(shù)藥物一樣,mRNA疫苗的不良反應(yīng)往往隨著劑量的增加而增加。例如,在CV7202的第一階段試驗(yàn)中,5μg劑量具有不可接受的毒性,而1μg是耐受性良好的最高劑量。此外,在Moderna H10N8流感疫苗的第一階段試驗(yàn)中,在400ug劑量患者出現(xiàn)嚴(yán)重不良事件,因此,試驗(yàn)以100μg劑量繼續(xù)。

在使用Pfizer–BioNTech和Moderna的COVID-19疫苗時(shí),分別在約百萬分之4．7和百萬分之2．5的接種者中觀察到過敏反應(yīng),這大約是傳統(tǒng)疫苗接種的2-4倍。一種說法認(rèn)為,過敏反應(yīng)歸因于人群中預(yù)先存在的針對LNP中聚乙二醇化脂質(zhì)的抗體。這些抗體被認(rèn)為對許多消費(fèi)品(例如牙膏、洗發(fā)水和瀉藥)中的PEG存在反應(yīng)。據(jù)報(bào)道,40%的人群中存在抗PEG抗體,這可能會增加某些個(gè)體發(fā)生過敏反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn),并阻礙疫苗的效力。目前,CDC建議,對于對Pfizer–BioNTech或Moderna疫苗的任何成分有過敏史的個(gè)人,不應(yīng)使用mRNA疫苗。很明顯,我們需要更好地理解mRNA疫苗配方是如何引起過敏反應(yīng)的,以便可以重新設(shè)計(jì)配方以改善安全性。

特定人群的疫苗接種

大多數(shù)疫苗,無論是傳統(tǒng)疫苗還是mRNA疫苗,都是針對兒童或健康成人開發(fā)的。然而,由于免疫系統(tǒng)的不同,一些人群可能受益于替代疫苗接種策略或?qū)σ呙缃臃N的反應(yīng)不同。

產(chǎn)婦/新生兒疫苗接種

懷孕期間免疫系統(tǒng)的動態(tài)特性增加了一個(gè)人對傳染病的易感性,而感染會對產(chǎn)婦健康和胎兒發(fā)育造成災(zāi)難性影響。

為了應(yīng)對這些挑戰(zhàn),產(chǎn)婦疫苗接種已成為改善產(chǎn)婦健康和降低新生兒發(fā)病率的工具。母體IgG抗體通過與新生兒Fc受體結(jié)合,很容易穿過胎盤,進(jìn)入胎兒循環(huán),保護(hù)胎兒免受病原體的侵害。在幾項(xiàng)研究中,母親接種mRNA負(fù)載的LNPs可防止懷孕小鼠中的胎兒寨卡病毒傳播,并保護(hù)新生小鼠免受皰疹病毒和鏈球菌的感染。

盡管垂直轉(zhuǎn)移的母體抗體可以防止新生兒感染,但它們也會阻礙對嬰兒在以后的生活中接種疫苗的效果,其機(jī)制尚不清楚。延長抗原的可用性可能促進(jìn)更強(qiáng)烈的生發(fā)中心反應(yīng),從而在存在母體抗體的情況下產(chǎn)生強(qiáng)大的嬰兒免疫反應(yīng)。

抗SARS-CoV-2的mRNA疫苗也被證明對懷孕和哺乳期人群具有免疫原性,并且在臍血和人類乳汁中檢測到中和抗體。初步數(shù)據(jù)表明,mRNA-1273和BNT162b2在懷孕和非懷孕人群中引發(fā)類似的不良事件,并且疫苗不會增加新生兒死亡或先天性異常的發(fā)生率。然而,需要進(jìn)一步的縱向研究來評估m(xù)RNA疫苗對產(chǎn)婦和新生兒健康的影響。

老年人

這一群體急需有效的疫苗,因?yàn)樵S多傳染病影響著老年人。例如,70至90%的流感相關(guān)死亡率發(fā)生在65歲以上的患者中,而COVID-19的死亡率在大于65歲的患者中是年輕患者的62倍。

老年人更難接種疫苗,因?yàn)槔淆g化對免疫系統(tǒng)的先天和適應(yīng)性反應(yīng)都有不利影響。Toll樣受體表達(dá)減少會阻止單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子和趨化因子,并限制與適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的串?dāng)_。由于細(xì)胞因子信號受損以及生理和細(xì)胞變化,感染期間的適應(yīng)性免疫反應(yīng)通常不充分。這些變化包括胸腺退化、幼稚B細(xì)胞和T細(xì)胞減少、T細(xì)胞受體多樣性減少、對T細(xì)胞凋亡的更高易感性以及細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞上關(guān)鍵受體如CD28的表達(dá)減少。

幸運(yùn)的是,越來越多的證據(jù)表明,mRNA疫苗可能在所有年齡組都具有強(qiáng)大的效力。例如,在III期試驗(yàn)中,Pfizer–BioNTech的候選疫苗BNT162b2在所有治療組中的療效均超過93%。Moderna候選疫苗mRNA-1273也非常有效,在≥65歲的志愿者中顯示出86．4%的有效性,相比之下,18-65歲志愿者的療效為95．6%。

運(yùn)載工具的設(shè)計(jì)對于提高老年人的疫苗效力非常重要。mRNA載體可以作為炎癥佐劑,通過增強(qiáng)抗原提呈細(xì)胞向注射部位的募集來放大疫苗反應(yīng)。在一項(xiàng)臨床前研究中,CureVac的RNAVAC激活了TLR7,并在小鼠中產(chǎn)生了針對致命流感的持久免疫應(yīng)答。諾華公司的乳劑MF59已經(jīng)被用作mRNA遞送載體,也可以作為佐劑。MF59增強(qiáng)了流感疫苗的免疫原性,已被批準(zhǔn)用于老年人。

疫苗的獲得

獲得疫苗是實(shí)現(xiàn)廣泛預(yù)防傳染病的最大挑戰(zhàn),特別是在低收入國家。目前批準(zhǔn)的SARS-CoV-2 mRNA疫苗的冷藏要求進(jìn)一步限制了疫苗的獲取。便攜式和可重復(fù)使用的Arktek冷凍柜可以在流行病期間實(shí)現(xiàn)數(shù)百萬劑疫苗的快速部署。

然而,在COVID-19病毒需要接種數(shù)十億人,這需要耐熱疫苗。目前,有兩種SARS-CoV-2候選疫苗在室溫下具有耐熱性,如果這些耐熱候選疫苗在臨床試驗(yàn)中能夠顯示出良好的結(jié)果,他們可能在不久的將來簡化全球?qū)�mRNA疫苗的獲取。

疫苗的接受度

疫苗只有在接種后才有效,支持疫苗安全性和有效性的數(shù)據(jù)非常豐富,疫苗已經(jīng)在世界部分地區(qū)根除了幾種傳染病,挽救了無數(shù)人的生命。然而,由于錯(cuò)誤信息和反疫苗運(yùn)動,公眾的不信任感加劇,威脅到群體免疫力的維持,并使我們最脆弱的人群處于危險(xiǎn)之中。

疫苗接種覆蓋率下降可能導(dǎo)致威脅生命的疾病再次出現(xiàn)。例如,2000年從美國根除的麻疹在2019年感染了1200多人,原因是多個(gè)社區(qū)的疫苗依從性差。對于COVID-19,在美國,目前56–75%的接受度可能不足以達(dá)到至少80–90%的覆蓋率,這一閾值被認(rèn)為是對SARS-CoV-2群體免疫所必需的。

盡管提高疫苗覆蓋率的大部分負(fù)擔(dān)落在政府和公共衛(wèi)生官員身上,科學(xué)界也可以通過提高mRNA疫苗的效力和安全性來提供幫助。提高療效將降低群體免疫所需的接受度,提高安全性將阻止媒體對不良事件的報(bào)道,從而減少對疫苗接種的恐懼。

小結(jié)

幾十年來,mRNA設(shè)計(jì)和核酸遞送技術(shù)的進(jìn)步,加上新抗原靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn),使得mRNA疫苗成為對抗新興流行病和現(xiàn)有傳染病的非凡工具。兩種針對SARS-CoV-2的mRNA疫苗,以革命性的速度研制,并提供了卓越的保護(hù)率,有望結(jié)束COVID-19的大流行。

此外,這些疫苗將LNP和RNA治療從小眾市場的產(chǎn)品提升為在大量人群中成功實(shí)施的預(yù)防性治療。由此產(chǎn)生大量的安全性和有效性數(shù)據(jù),以及成功的監(jiān)管部門批準(zhǔn)。我們可以樂觀地認(rèn)為,mRNA療法將可能改變現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的疫苗接種方法、癌癥免疫療法以及蛋白質(zhì)替代療法。

參考文獻(xiàn):

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