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前言

抗體偶聯(lián)藥物(ADCs)在過去10年中取得了長足的進展,ADC是一種通過一個合理構建的連接子將細胞毒性小分子藥物偶聯(lián)到單克隆抗體上的復合物,可以向腫瘤內選擇性地輸送有效的細胞毒性藥物。

2009年gemtuzumab ozogamicin(Mylotarg) 是美國食品和藥物管理局(FDA)批準的第一個ADC藥物。目前,FDA已經批準上市了11個ADC藥物,還有上百個ADC藥物正處于臨床研究階段。  

2009年,卡利霉素、金盞花素和美登素類藥物是用于ADC開發(fā)的主要細胞毒素。十年來,這些分子仍然被用作有效載荷進行優(yōu)化,以獲得更好的穩(wěn)定性和親水性。新的細胞毒性物質也被開發(fā)出來,如PBDs、杜卡霉素和喜樹堿衍生物等。

抗體工程在10年間也已經取得了相當大的進展,允許更多的位點特異性偶聯(lián),提高了ADC的均一性和穩(wěn)定性。新的第二代和第三代ADC已經進入臨床,以期獲得更好的治療效果和安全性。幾十種基于半胱氨酸殘基、非天然氨基酸或分子工程模式的生物偶聯(lián)技術也已經在臨床前研究獲得了驗證。此外,更多的腫瘤特異性抗原靶點和腫瘤內細胞毒性藥物的釋放機制使ADC獲得了爆炸式的發(fā)展,ADC藥物進入了黃金時代。

第一代和第二代ADC

一個成功的ADC藥物取決于兩個關鍵因素。第一需要一個穩(wěn)定可靠的連接子連接抗體和有效載荷,這個連接子在血漿循環(huán)中保持穩(wěn)定,并且在腫瘤細胞內吞后迅速切割,以便有選擇地將有效載荷傳遞到腫瘤中,并限制由于非靶向毒性引起的不良反應。連接子需要對溶酶體條件(蛋白酶、酸性和還原介質)敏感。

第二個成功的關鍵因素是必須將一種強大的細胞毒性劑偶聯(lián)到抗體上。事實上,由于有效載荷(例如蒽環(huán)類藥物)的效力較低,第一批ADC的特點是治療指數(shù)較低,導致到達最大耐受劑量(MTD)時治療效果依然非常有限。

Mylotarg、Besponsa和第一代可切割連接子

Mylotarg于2000年被FDA批準用于治療急性髓細胞白血病(AML)。它是由卡奇霉素通過一個包含腙鍵的可切割連接子與gemtuzumab(一種突變的抗CD33 IgG4亞型單抗)偶聯(lián)而成。這種ADC的平均藥物抗體比(DAR)只有1．5,含有約50%的未偶聯(lián)單克隆抗體。ADC內化后,腙鍵可在內體酸性環(huán)境中水解,釋放出卡奇霉素的前體,然后由谷胱甘肽還原為自由活性的卡奇霉素。后者與DNA小凹槽結合并經歷Bergman環(huán)化,從而產生高度反應性的雙自由基,引起序列選擇性DNA雙鏈切割。

從理論上講,腙在生理pH值下應在血液循環(huán)中保持穩(wěn)定,并在酸性條件下內化后進行選擇性水解。然而,Mylotarg的連接子表現(xiàn)出一定的不穩(wěn)定性,導致卡奇霉素在血漿循環(huán)中過早釋放,嚴重的毒性導致隨后輝瑞公司在2010年將Mylotarg退市。

得益于近年來在臨床上積累的經驗以及技術的進步,Mylotarg于2017年重新獲批,優(yōu)化后提高了連接子的穩(wěn)定性,以較低劑量使用,并修改給藥計劃,適用于不同的患者群體。

一個類似的連接子被開發(fā)出來并用于將卡奇霉素偶聯(lián)到inotuzumab,一種突變的CD22靶向抗體上, inotuzumab-ozogamicin (Besponsa)于2017年被FDA批準用于治療急性淋巴細胞白血病(ALL)。

Kadcyla和第二代不可切割連接子

鑒于這些發(fā)現(xiàn),人們繼續(xù)開發(fā)連接子設計的替代策略。然而,一個偶然的發(fā)現(xiàn)使Immunogen得以識別出一種出人意料的有效ADC。DM1通過含有N-琥珀酰亞胺基-4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸鹽(SMCC)的不可切割的連接子與曲妥珠單抗的賴氨酸殘基偶聯(lián),這種ADC(T-DM1,Kadcyla)于2013年經FDA批準用于HER2陽性乳腺癌患者。

這種新型的ADC在HER2陽性乳腺癌模型中非常有效,只有ADC在內化后在溶酶體中經酶完全消化后,原始結構才具有活性,以獲得活性代謝物Lys-MCC-DM1。

Adcetris, Polivy和第二代可切割連接子

與此同時,西雅圖遺傳學設計了自己的偶聯(lián)技術,通過可切割連接子mc-VC-PABC,其中包含馬來酰亞胺基間隔子、作為組織蛋白酶底物的標準Val Cit二肽序列和PABC自降解間隔子,將金盞花素(MMAE)生物偶聯(lián)到抗CD30 抗體的半胱氨酸殘基上,這種ADC(Adcetris)于 2011年被FDA批準用于間變性大細胞淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤的治療。

Adcetris在腫瘤細胞內化后,可切割連接子降解,釋放出的MMAE能破壞靶細胞并擴散到細胞膜上,到達并殺死鄰近的癌細胞。這種現(xiàn)象被稱為旁觀者效應,允許釋放的MMAE殺死CD30陽性和CD30陰性的腫瘤細胞。

類似地,這種第二代連接子(mc-VC-PABC)被用于Polivy,一種將MMAE與polatuzumab(抗CD79b單抗)偶聯(lián)的ADC,于2019年6月被FDA批準用于治療成人彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)。

第三代ADC

由于前兩代ADC包括單抗的內化、轉運或再循環(huán)有關的干擾、抗原的脫落以及 ADC 的溶酶體降解缺陷都會導致藥物釋放的減少,從而影響 ADCs 的療效。因此,亟需開發(fā)與生物偶聯(lián)、載體形式、連接子或毒性藥物相關的新技術,以拓寬 ADC 的應用領域,第三代ADC應運而生。

位點特異性的ADC

盡管ADC取得了越來越大的成功,但直到2019年,市場上每一個批準的ADC都是以異質混合物的形式存在的,單抗上的細胞毒性藥物數(shù)量不同且分布在不同的地方,導致了生產過程中的分析問題。事實上,DAR是不受控制的,這種復雜的混合物會顯著影響ADC的藥代動力學和藥效。

裸抗體可能是一種競爭性抑制劑,弱DAR偶聯(lián)物的療效較差,而具有高DAR的抗體在血漿中會被迅速消除,從而損害了ADC的治療窗口。為了拓寬ADCs的治療指數(shù),自2008年以來,區(qū)域特異性生物結合方法得到廣泛發(fā)展。這些位點特異性方法可分為三類:(i)天然或非天然氨基酸的生物偶聯(lián),(ii)使用酶的生物偶聯(lián)或(iii)基于連接物的生物偶聯(lián)。

第一種方法是通過抗體工程引入特定的氨基酸。Junutula和他在Genentech的同事是先驅者,他們通過在靶向卵巢癌抗原MUC16的單克隆抗體的265位氨基酸與Adcetris?連接子進行定點生物偶聯(lián),開發(fā)出一種ADC。為此,他們在單克隆抗體的氨基酸序列中引入了兩種半胱氨酸,選擇了這兩種半胱氨酸來保持IgG折疊和與抗原結合。

將得到的TDC(ADC-硫單抗)與使用傳統(tǒng)隨機生物結合方法生成的ADC進行比較。

兩種ADC在小鼠異種移植模型中均有效,但TDC在大鼠和食蟹猴體內的耐受性高于ADC,并且在體內表現(xiàn)出較低的全身毒性。受此策略的啟發(fā),Seattle Genetics和Spirogen開發(fā)了一種類似的技術,稱為MAIA,通過在mAb關鍵區(qū)域的239位引入絲氨酸半胱氨酸突變,實現(xiàn)PBD二聚體的生物偶聯(lián)。

第二種可能性是使用酶介導的區(qū)域特異性生物結合技術。谷氨酰胺轉胺酶催化天然單抗的谷氨酰胺側鏈與含有伯胺的分子之間形成酰胺鍵�；�于此,Innate Pharma已經開發(fā)了一種使用谷氨酰胺轉胺酶構建ADC的三步方法,如下圖所示。

最后,區(qū)域特異性ADC也可以從天然單抗中產生。

在這一策略中,由創(chuàng)新的二溴甲基酰胺(DBM)或二噻吩基馬來酰亞胺(DSPh)組成的異質雙功能連接體可以通過區(qū)域特異性生物偶聯(lián)產生更均勻和更穩(wěn)定的ADC,DAR為4。

其它ADC形式

盡管其療效顯著,但大多數(shù)針對實體腫瘤的ADC并沒有超過2期臨床試驗的進展,這表明,為了進入市場,還需要優(yōu)化其他參數(shù)。ADC的有效性受到其大小(150 kDa)的限制,與腫瘤的穿透和吸收不良有關。除了IgG的大小,現(xiàn)在人們認為IgG的Fc部分對于ADC的療效來說是不必要的,甚至是不需要的,事實上,由FcRn誘導的ADC半衰期較長增加了對健康組織的暴露,而FcγR與內皮細胞和免疫系統(tǒng)發(fā)生交叉反應,這兩種現(xiàn)象與靶外毒性有關。

較小的結合形式已被探索以彌補這些缺點,特別是肽、單域抗體片段(sdAb或VHH)、單鏈抗體(scFv)、抗原結合片段(Fab)或使用CHε4結構域二聚化的小免疫蛋白(SIP)。作為該策略的一部分,最近,auristatin衍生物與抗HER2單鏈抗體(源自曲妥珠單抗)的位點特異性偶聯(lián)產生了兩種新的單鏈抗體藥物偶聯(lián)物(SDCs)。

與天然單鏈抗體相比,這兩種SDC保持了對HER2的親和力,并且能夠在體外有效地殺死SK-BR-3her2陽性細胞(EC50分別為0．68nm和0．32nm),對HER2陰性MCF-7細胞無影響。

盡管DAR為1的SDC不如相應的DAR為4的ADC強大,但這項工作代表了設計具有更高DAR的更有效的小型結合物的第一步,為進一步的體內或甚至臨床研究開辟了道路,以評估其對實體瘤的潛力。

目前以HER2為靶點的ADC在清除表達相對較低HER2+癌細胞方面是無效的。因此,只有大約20%的乳腺癌患者有資格接受HER2靶向治療。此外,HER2表達的腫瘤內異質性最終導致最初對治療有反應的患者復發(fā)。為了在具有更廣泛HER2表達范圍的癌細胞中獲得有效的抗腫瘤活性,MedImmune開發(fā)了針對HER2的雙翼ADC IMMU4276。

與Kadcyla?相比,在代表不同亞群患者的各種腫瘤模型中,這種雙翼ADC顯示出優(yōu)越的抗腫瘤活性。此外,兩個組合突變(L234F和S239C)減少了與FcγR的結合,以減少FcγR介導的正常組織中ADC特異性內化,從而減少了血小板減少等副作用的發(fā)生。不幸的是,由于高肝毒性,2018年該ADC也在臨床停止。

新靶標和相關釋放系統(tǒng)

在富含細胞間質的實體瘤中,在癌細胞表面靶向內化抗原是非常困難的。因此,一種新的方法被開發(fā)出來,由腫瘤微環(huán)境(基質或血管系統(tǒng))代替癌細胞。在這種策略中,細胞外蛋白酶和細胞外基質的其他成分(如酸性介質或還原性谷胱甘肽)可用于有效的細胞外釋放用于非內化ADC的細胞毒性。

纖維連接蛋白是腫瘤內皮下細胞外基質的一種成分,與癌細胞表面相比,更容易獲得免疫結合。SIP形式是單鏈抗體片段與人IgEεCH4結構域融合的結果。SIP(F8)在C-末端位置用兩個未成對的半胱氨酸殘基生成,允許兩個DM1分子進行區(qū)域特異性生物偶聯(lián),以產生SIP(F8)-SS-DM1的DAR=2的偶聯(lián)物。

在治療實驗中,SIP(F8)-SS-DM1比IgG(F8)-SS-DM1的類似物效果更好。

在F9畸胎瘤小鼠模型中,以5mg/kg 5次注射給藥,以相等(等摩爾)劑量在體內比較兩種偶聯(lián)物。SIP偶聯(lián)物使五分之四的小鼠腫瘤完全緩解,而IgG結合物僅觀察到有限的腫瘤緩解。這兩種結合物也被證明在細胞毒性DM1釋放動力學方面存在顯著差異。非內化ADC的優(yōu)點是避開了免疫結合物內化的某些抵抗機制,而區(qū)域特異性生物結合方法控制DAR,避免了DAR為0的成分出現(xiàn)。

新型細胞毒性藥物

新的細胞毒藥物已經被開發(fā)出來,以靶向低抗原表達或對auristatins或maytansinoids耐藥的癌細胞。為此,人們開發(fā)了PBD二聚體,這些二聚體的分子結構包含兩個烷基化亞胺官能團,能夠與DNA形成共價鍵。PBD二聚體比傳統(tǒng)細胞毒性藥物(MMAE或DM1)的效力高約50-100倍。Spirogen和Seattle Genetics將PBD二聚體作為ADC細胞毒性物質引入,并開發(fā)了SGN-CD33A(vadastuximab-Talinine)和SGN-CD70A,然而很不幸,這兩種基于PBD的ADC最近在III期臨床試驗中被迫停止。SGN-CD33A與致命感染和可能的肝毒性導致的較高的患者死亡率相關,而SGN-CD70A與血小板減少有關。

雖然在臨床試驗期間停止了使用talirine的ADC,但兩個使用相應的tesirine的ADC處于臨床研究的高級階段。Rovalpituzumab tesirine(Rova-T或SC16LD6．5)是由abbvie(Stemcentrx)開發(fā)的抗DLL3 ADC,在小細胞肺癌的III期臨床試驗中進行了測試。

ADC Therapeutics開發(fā)了loncastuximab-tesirine(ADCT-402)和camidanlumab-tesirine(ADCT-301),這兩種藥物都在關鍵的II期臨床階段分別針對B細胞急性淋巴細胞白血病和霍奇金淋巴瘤進行了測試。

Genentech最近開發(fā)了一種新的抗CD22-NMS249 ADC,新的蒽環(huán)類化合物命名為PNU-159682。蒽環(huán)類藥物是目前應用最廣泛的化療藥物之一,在治療侵襲性非霍奇金淋巴瘤(NHL)方面非常有效。該ADC使用MC-VC-PAB-DEA接頭,帶有一個加長的自鎖間隔區(qū),除了傳統(tǒng)的PAB外,還包括N,N′-二甲基乙二胺(DEA)。在體內,這種抗CD22-NMS249 ADC在異種移植瘤模型中與抗CD22-VC-MMAE ADC一樣有效,而在基于抗CD22-VC-MMAE ADC的細胞系的模型中仍然有效。證明了蒽環(huán)類ADC在治療MMAE耐藥癌癥中的有效性。

作為先前所述ADC的替代品,海德堡制藥公司開發(fā)了一種稱為ATAC(針對抗體靶向鵝膏蛋白結合物)的專利技術,該技術基于強RNA聚合酶II抑制劑。α-和β-鵝膏堿是兩種著名的鵝膏毒素,在四十多年前的蘑菇中鑒定出來。HDP-101是由HDP30．2115(α-鵝膏蛋白的穩(wěn)定類似物)通過組織蛋白酶B敏感連接物與靶向B細胞成熟抗原(BCMA,CD269)的硫單抗(由Genentech設計)定點偶聯(lián),產生DAR為2的ATAC。

BCMA已經成為治療多發(fā)性骨髓瘤的一個非常有選擇性的靶點。在體內,在多發(fā)性骨髓瘤的各種異種移植模型中,HDP-101導致小鼠腫瘤完全緩解,安全性研究在小鼠和猴子身上確定了一個非常有利的治療窗口。ATACs是一類非常有前途的化合物,但目前仍處于臨床前階段。

第三代的成功典范:Enhertu和Trodelvy

在許多開發(fā)ADC的公司中,Immunomedics設計了一個令人驚訝的ADC,通過三重賭注:構建一個針對稍微過表達靶點的ADC,使用了一個混合了細胞內和細胞外釋放的系統(tǒng),以及比常規(guī)使用的有效載荷更弱的毒性藥物。Sacituzumab-govitecan(IMMU-132)是一種抗TROP-2單抗,通過具有短聚乙二醇化單元的可裂解馬來酰亞胺連接體與SN-38(伊立替康的活性代謝物)偶聯(lián)。

FDA于2020年4月批準,這一成就令人印象深刻,因為這種ADC用于難治或耐藥的三陰性乳腺癌(TNBC),之前沒有有效的治療藥物。這種ADC的另一個有趣的特點是:包括聚乙二醇化單元的連接結構的優(yōu)化使得該ADC的DAR高達7．6,而不會影響其耐受性或效率。DAR=4長期以來被認為是最佳的,但這一說法現(xiàn)在只適用于已知認可的ADC,其有效載荷為DM1或MMAE的第二代接頭。

同樣,為了使伊立替康衍生物與精心設計的連接體結合,日本第一三共公司開發(fā)了DXd(exatecan或DX-8951)。DXd是一種比SN-38體外對癌細胞活性高10倍的細胞毒性劑。DXd具有更好的安全性和最佳的溶解度,能夠引起旁觀者殺傷效應殺死鄰近的癌細胞,這在異質性腫瘤中是一個優(yōu)勢,但半衰期短,可避免靶外毒性。

通過對蛋白水解敏感的馬來酰亞胺連接體將DXd生物結合到抗HER2曲妥珠單抗半胱氨酸殘基上,使得獲得均勻DAR為7．7的共軛fam-trastuzumab-deruxtecan nxki(DS-8201a)。盡管DAR很高,但第一三共的DS-8201a在大鼠和猴子中的耐受性非常好,并且在血漿中非常穩(wěn)定。

DS-8201a能夠在體內有效地將DXd輸送到異質性腫瘤中,并顯示出很高的治療效果。去年,在轉移性HER2陽性乳腺癌的III期臨床研究中,DS-8201a成功地與T-DM1進行了比較,并最終于2019年12月底獲得FDA批準。

ADC的毒性

Gemtuzumab-Ozogamicin

Gemtuzumab ozogamicin(Mylotarg)于2000年被FDA批準用于治療某些急性髓細胞白血病(AML)患者。2001年,由于觀察到靜脈阻塞性疾病的病例,FDA發(fā)出了警告。2004年,一項隨機研究比較了傳統(tǒng)療法以及與Mylotarg 聯(lián)合的效果,結果由于后者死亡率的增加而提前停止試驗。2010年Mylotarg從除日本外的大多數(shù)市場撤出。

由于第一次臨床研究中可用的分析方法有限,Mylotarg后來才被確定為DAR方面的異質產品。雖然理論DAR值在2．5左右,但藥物中50%以上的抗體沒有被偶聯(lián),其他抗體的DAR值為4或5。同時,Mylotarg僅確定一個劑量的方案難以獲得滿意的治療指數(shù),不得不放棄開發(fā)。

然而,后續(xù)法國急性白血病協(xié)會(ALFA)的研究表明,將給藥分為三個劑量,既提高了存活率,又沒有發(fā)生嚴重不良事件。于是,Mylotarg于2017又重新獲批上市。。

Brentuximab Vedotin

Brentuximab vedotin(Adcetris)于2011年被批準用于治療某些表達CD30的淋巴瘤,包括霍奇金淋巴瘤和間變性大細胞淋巴瘤。然而,Adcetris作為單藥治療,臨床上表現(xiàn)出潛在的嚴重周圍神經病變、中性粒細胞減少癥和血小板減少癥,這是抗血小板藥物的典型副作用。另一方面,觀察到進行性多灶性白質腦病的罕見而嚴重的病例。

另外,Adcetris與博萊霉素(一種治療霍奇金病的常用藥物)聯(lián)用,發(fā)現(xiàn)會導致不可接受的肺毒性,這種組合因此被排除。

ADC的典型或非預期毒性

根據(jù)ADC的有效載荷藥物分類,如微管破壞劑(auristatins和maytansinoids)、抗有絲分裂抑制劑(KSPis)或DNA損傷藥物(calichaemycin和PBD),某些毒性是可以預期觀察到的。這些包括可達4級的骨髓毒性,敏感的神經和生長毒性。

另一方面,也報告一些在標準細胞毒性藥物上沒有觀察到的的副作用。這些包括眼部毒性,如角膜炎或含有MMAF或DM4的ADC引起的角膜沉積物,這可能構成這些ADC藥物的限制性毒性。Kadcyla已經證明會增加放射性壞死的風險。對這些非預期毒性的理解和管理對優(yōu)化使用這些藥物是至關重要的。

ADC耐藥的機制

ADCs在腫瘤靶細胞水平上的作用機制包括幾個階段:與抗原結合,內化,藥物釋放(主要在溶酶體中),藥物釋放到細胞質中,藥物作用于靶標誘導細胞凋亡。這些步驟中的每一步都可能與體外或體內的臨床前研究所提示的抗藥性有關:

(i)靶抗原的下調和/或抗體的結合、內化、運輸或再循環(huán)缺陷;

(ii)ADC的溶酶體降解缺陷或溶酶體轉運體如SLC46A3的表達減少,導致胞漿中有效載荷的釋放降低;

(iii)微管蛋白或微管動力學調節(jié)劑的改變;

(iv)通過上調耐藥轉運體如MDR1減少藥物在細胞內的滯留。

這些潛在耐藥機制的臨床相關性仍有待證實。事實上,在ADC治療開始前和治療后復發(fā)期間獲取腫瘤樣本是很復雜的。另外,在聯(lián)合治療的背景下,從其他藥物中辨別抗ADC的耐藥機制也同樣復雜。

小結

在過去的十年中,ADCs已經通過選擇更好的細胞毒性藥物、生物偶聯(lián)方法、更好的靶向抗原和優(yōu)化的抗體工程得到了改進。然而,它仍存在一些局限性(如有限的實體瘤滲透性和毒性)以及耐藥機制的出現(xiàn)。

為了克服這些局限性,人們研究了新的抗體形式、新的傳遞系統(tǒng)、非內化抗原靶點、新的細胞毒性藥物和位點特異性生物偶聯(lián)方法來促進ADC的發(fā)展。雖然許多創(chuàng)新尚未在臨床方案中得到驗證,但這一領域的研究為我們提供了許多令人鼓舞的結果。相信ADC未來的十年將會迎來更加輝煌的前景。

參考文獻:

1． Antibody–Drug Conjugates: The Last Decade． Pharmaceuticals 2020, 13, 245