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前言

截至2023年7月1日，新冠肺炎已導(dǎo)致全球超過7.6億病例和690萬人死亡。作為一種單鏈β屬冠狀病毒，SARS-CoV-2利用宿主機(jī)制進(jìn)行復(fù)制。刺突蛋白是SARS-CoV-2感染的關(guān)鍵包膜糖蛋白，其組裝成三聚體，分為兩個(gè)亞基，S1和S2，它們之間包含弗林蛋白酶切割位點(diǎn)。S1亞基主要負(fù)責(zé)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE2）的初始相互作用和結(jié)合，而S2亞基則實(shí)現(xiàn)膜融合。

S1亞基包含一個(gè)直接與ACE2結(jié)合的受體結(jié)合位點(diǎn)（RBD），以及一個(gè)N末端結(jié)構(gòu)域（NTD），該結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為是Spike主要的功能結(jié)構(gòu)域。相反，S2結(jié)構(gòu)域包含兩個(gè)七肽重復(fù)區(qū)（HR1和HR2）以及融合肽結(jié)構(gòu)域（FP）。FP在RBD介導(dǎo)的Spike-ACE2相互作用后立即發(fā)揮作用，將其自身插入宿主膜，引起劇烈的構(gòu)象變化，使HR1和HR2結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞膜接近，導(dǎo)致膜融合和病毒內(nèi)化。

刺突蛋白識(shí)別并結(jié)合宿主ACE2受體，通過內(nèi)吞作用使病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞。進(jìn)入后，病毒RNA逃離宿主內(nèi)體，并利用細(xì)胞的翻譯機(jī)制產(chǎn)生病毒蛋白，然后從宿主細(xì)胞組裝和釋放病毒顆粒。由于Spike蛋白依賴于宿主細(xì)胞的翻譯機(jī)制，因此它會(huì)受到翻譯后修飾（PTM）的影響，這可能會(huì)改變Spike介導(dǎo)的宿主病毒相互作用和宿主免疫反應(yīng)。特別是糖基化，已被證明會(huì)影響各種生物分子與刺突蛋白的相互作用。

刺突蛋白作為疫苗設(shè)計(jì)和治療的主要靶點(diǎn)一直受到科學(xué)界的關(guān)注�；�于刺突蛋白的疫苗引發(fā)的宿主免疫細(xì)胞反應(yīng)可大致分為三組：先天免疫反應(yīng)，部分是toll樣受體（TLRs）識(shí)別的結(jié)果；T細(xì)胞反應(yīng)和B細(xì)胞反應(yīng)。簡言之，疫苗中的先天受體配體如TLR配體可以激活先天免疫細(xì)胞，特別是抗原呈遞細(xì)胞（APC），其進(jìn)一步啟動(dòng)CD4+和CD8+T細(xì)胞的激活。在活化的CD4+T細(xì)胞中，濾泡輔助性T細(xì)胞（Tfh）有助于B細(xì)胞活化、漿細(xì)胞成熟和抗體產(chǎn)生，而1型輔助性T（Th1）細(xì)胞有助于增強(qiáng)APC功能、CD8+T細(xì)胞活化和細(xì)胞毒性。疫苗引發(fā)的抗體通過中和病毒提供保護(hù)，而細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）消除受感染的宿主細(xì)胞以促進(jìn)感染的清除。免疫亞群的特異性在很大程度上受到疫苗佐劑的影響，而疫苗引發(fā)的抗體和CTL的特異性主要由疫苗的抗原免疫表位決定。

刺突蛋白介導(dǎo)的宿主病毒相互作用是SARS-CoV-2進(jìn)化的主要驅(qū)動(dòng)因素。在新冠肺炎首次爆發(fā)后的三年時(shí)間里， SARS-CoV-2毒株的刺突蛋白積累了40多個(gè)突變。鑒于大多數(shù)疫苗都是專門針對刺突蛋白的，這可能在一定程度上解釋了疫苗效力在相對較短的時(shí)間內(nèi)急劇下降的原因。隨著最近接種疫苗人群中突破性SARS-CoV-2感染病例的增加，很明顯，需要開發(fā)對新出現(xiàn)的SARS-CoV-2變種有抵抗力的通用疫苗。

SARS-CoV-2刺突蛋白與Toll樣受體的相互作用

TLRs指導(dǎo)先天免疫系統(tǒng)細(xì)胞的激活和定位，最終控制宿主對感染和疫苗接種的初始反應(yīng)�；�于結(jié)構(gòu)的預(yù)測表明，多個(gè)Spike殘基可能與TLR1、TLR4和TLR6相互作用。預(yù)測參與與TLRs直接相互作用的位點(diǎn)主要位于RBD側(cè)翼的Spike S1亞基，包括NTD和S1上RBD C末端的區(qū)域。

值得注意的是，該區(qū)域內(nèi)所有殘基在所有SARS-CoV-2變體之間的遺傳變異程度非常低，表明TLR相互作用殘基相對保守。因此，即使在出現(xiàn)新變種的情況下，疫苗引發(fā)的對這些區(qū)域的免疫反應(yīng)也可能誘導(dǎo)交叉反應(yīng)和持久的保護(hù)。這些區(qū)域與TLR相互作用，并有助于誘導(dǎo)APC增強(qiáng)的初始反應(yīng)，這有助于提高疫苗效力。

盡管這種增強(qiáng)的初始反應(yīng)通常有利于激發(fā)宿主對病毒的免疫力，但過度炎癥與疫苗的不良反應(yīng)以及嚴(yán)重的新冠肺炎有關(guān)。因此，除了潛在的益處外，這些TLR相互作用的基序還應(yīng)考慮潛在的疫苗相關(guān)不良反應(yīng)。將TLR激動(dòng)劑作為佐劑納入疫苗開發(fā)中一直是一種流行的策略，已經(jīng)取得了許多成功。然而，了解疫苗抗原中內(nèi)源性TLR的激動(dòng)特性對于指導(dǎo)新發(fā)疾病的額外佐劑選擇至關(guān)重要。雖然TLR激動(dòng)劑的加入可能對大多數(shù)人群的疫苗效力有益，但它們也可能會(huì)引發(fā)由過度先天免疫反應(yīng)介導(dǎo)的疫苗相關(guān)急性炎癥。

SARS-CoV-2刺突蛋白的T細(xì)胞表位

作為適應(yīng)性免疫反應(yīng)的主要驅(qū)動(dòng)因素，T細(xì)胞調(diào)節(jié)對SARS-CoV-2感染的體液和細(xì)胞免疫，并在維持長期免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究表明，包括奧密克戎BA.5毒株在內(nèi)的SARS-CoV-2變異毒株（VOCs）之間存在T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。這種交叉反應(yīng)性T細(xì)胞免疫可能是早期新冠肺炎疫苗對這些新毒株產(chǎn)生抵抗的主要驅(qū)動(dòng)因素，這表明T細(xì)胞免疫表位在通用疫苗開發(fā)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

T細(xì)胞主要識(shí)別人類主要組織相容復(fù)合體（MHC）上存在的長度為8-15個(gè)氨基酸的短肽。T細(xì)胞表位的生物信息學(xué)分析顯示，SARS-CoV-2的T細(xì)胞表位庫相對較小。21種肽中有9種顯示出較高的平均遺傳變異水平，這表明T細(xì)胞相互作用可能有助于SARS-CoV-2的進(jìn)化。這9個(gè)表位都屬于NTD和RBD。

從結(jié)構(gòu)上講，RBD和NTD在SARS-CoV-2與宿主受體的相互作用中都至關(guān)重要。包括NTD和RBD在內(nèi)的S1突變豐富，這可能是由于它們積極參與宿主-病毒相互作用，選擇壓力所導(dǎo)致的。相反，刺突S2亞基中的T細(xì)胞表位表現(xiàn)出相對較低的遺傳變異率，這可能是因?yàn)镾2結(jié)構(gòu)域較少參與病毒和宿主受體/抗體之間的直接相互作用。鑒于相對較低的遺傳變異性，落在S2區(qū)域內(nèi)的TCR表位可能是通用疫苗開發(fā)的交叉反應(yīng)性T細(xì)胞記憶反應(yīng)的候選靶點(diǎn)。

SARS-CoV-2刺突蛋白的B細(xì)胞表位

B細(xì)胞在SARS-CoV-2感染引起的適應(yīng)性免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。B細(xì)胞具有產(chǎn)生細(xì)胞因子、分泌中和抗體和抗原呈遞等功能。在新冠肺炎的背景下，已知B細(xì)胞的主要保護(hù)作用是分泌中和抗體以防止初始感染和病毒傳播。

中和抗體的作用是結(jié)合SARS-CoV-2，主要是刺突蛋白，并通過空間阻斷病毒顆粒與宿主受體的相互作用來阻止病毒顆粒進(jìn)入細(xì)胞�？筍pike結(jié)合抗體的生物信息學(xué)分析顯示，從人類血清中分離出4000多種具有不同抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體。雖然刺突蛋白的多個(gè)區(qū)域都能夠引發(fā)抗體反應(yīng)，但在中和試驗(yàn)中，這些抗體中似乎只有一小部分能夠抑制SARS-CoV-2感染。中和抗體表位的鑒定，特別是廣泛中和的抗體表位，將有助于未來治療方法和通用疫苗的開發(fā)。

通過分析患者抗體識(shí)別的SARS-CoV-2刺突蛋白表位，發(fā)現(xiàn)似乎只有三個(gè)重復(fù)出現(xiàn)的區(qū)域與患者血清抗體結(jié)合并有效中和SARS-CoV-2，其中大多數(shù)發(fā)生在刺突蛋白的RBD之外。患者抗體識(shí)別的許多表位具有高溶劑可及度，并在RBD內(nèi)經(jīng)歷高突變率。這一觀察結(jié)果與SARS-CoV-2的RBD突變在抗體中和的免疫逃逸以及病毒進(jìn)化中發(fā)揮作用的觀點(diǎn)密切一致。

有趣的是，位于RBD外的Spike蛋白的中和表位似乎是保守的，盡管它們具有中等至高溶劑可及性。特別是，S2結(jié)構(gòu)域中的表位顯示出低遺傳變異、高溶劑可及性，并且通常被患者的抗體識(shí)別，從而產(chǎn)生良好的中和作用。因此，這些表位可能是通用疫苗開發(fā)的有希望的靶點(diǎn)。

SARS-CoV-2刺突免疫表位的糖基化

糖基化是大多數(shù)生物體內(nèi)最常見的翻譯后修飾，包括O-糖基化和N-糖基化。糖基化可以通過與細(xì)胞凝集素的相互作用起到粘附分子的作用，這可能最終驅(qū)動(dòng)修飾蛋白的運(yùn)輸和亞細(xì)胞定位。糖基化也可能掩蓋表面分子的呈遞，這可能改變各種病原體呈遞的蛋白質(zhì)和肽的抗原性。最后，糖基化可以通過影響蛋白質(zhì)的局部構(gòu)象及其熱穩(wěn)定性來顯著改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)。

在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生SARS-CoV-2蛋白的過程中，宿主分子機(jī)制也會(huì)對病毒蛋白產(chǎn)生糖基化，包括刺突蛋白。據(jù)預(yù)測，SARS-CoV-2刺突蛋白含有多達(dá)27個(gè)糖基化位點(diǎn)，主要是N-糖基化，其中大多數(shù)已得到證實(shí)。

對免疫相關(guān)位點(diǎn)內(nèi)SARS-CoV-2刺突蛋白上發(fā)現(xiàn)的糖基進(jìn)行比較表明，部分糖基化發(fā)生在免疫系統(tǒng)識(shí)別的幾個(gè)位點(diǎn)。例如，N801糖基屬于B細(xì)胞表位，N657可能與TLR4相互作用。此外，Spike蛋白中的大多數(shù)糖基化是高度保守的。

有趣的是，N801被證明是抗體識(shí)別的有效表位，該糖基位于融合肽內(nèi)，并且也靠近S2結(jié)構(gòu)域中中和抗體經(jīng)常靶向的區(qū)域。一個(gè)重要的觀察結(jié)果是，含有N801的免疫表位在所有VOC中都是非常保守的，這使其成為廣泛中和和通用疫苗設(shè)計(jì)的一個(gè)有前途的候選表位。

除了N801之外，糖基化位點(diǎn)N61、N74、N149、N165、N343和N1074與已知參與TCR相互作用的區(qū)域重疊，而S673和N1158也屬于已知在抗體結(jié)合時(shí)引發(fā)中和的區(qū)域。

刺突免疫表位在通用疫苗開發(fā)中的考量

分析表明，靠近N149、N165、N343、N801和N1158的區(qū)域具有免疫原性，并且相對保守。這些區(qū)域參與可以與TCRs或免疫球蛋白相互作用的免疫表位，并且具有低遺傳變異，使其成為通用疫苗開發(fā)的有前景的抗原位點(diǎn)。

此外，這些區(qū)域受益于低遺傳變異，這可能是由這些糖基化的結(jié)構(gòu)和功能作用引起的。這種相對保護(hù)可能會(huì)降低未來SARS-CoV-2變異株逃避疫苗誘導(dǎo)免疫的可能性。此外，這種完全相同的糖基化也可能在宿主-病毒相互作用和針對這些位點(diǎn)的免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。因此，重要的是進(jìn)一步研究針對這些區(qū)域的疫苗中糖基化的影響。

在選擇疫苗抗原時(shí)，必須考慮“裸”抗原的免疫原性及其翻譯后修飾，因?yàn)樗鼈儠?huì)顯著影響蛋白質(zhì)與免疫系統(tǒng)的功能和相互作用。例如，最近的研究比較了倉鼠和小鼠免疫中去糖基化和完全糖基化的刺突蛋白，發(fā)現(xiàn)去糖基性刺突蛋白增強(qiáng)了保護(hù)性免疫。此外，去除RBD中或S2結(jié)構(gòu)域中的糖基導(dǎo)致兩個(gè)區(qū)域中更保守的表位暴露，引發(fā)廣泛的保護(hù)性免疫。這些效應(yīng)可能在一定程度上是由“裸”刺突蛋白中肽表位更好的可及性或改變的穩(wěn)定性造成的。

小結(jié)

對SARS-CoV-2刺突免疫表位的深入了解對于開發(fā)針對刺突蛋白的通用疫苗和廣泛有效的療法至關(guān)重要。我們清楚地知道，SARS-CoV-2仍將繼續(xù)進(jìn)化，需要新的疫苗來應(yīng)對新出現(xiàn)的變種。這一需求要求我們開發(fā)對廣泛的嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2型SARS-CoV-2變種有效的新型疫苗。

疫苗引發(fā)的抗體反應(yīng)對保護(hù)性免疫至關(guān)重要，但在接種疫苗后一年內(nèi)會(huì)迅速減弱�？乖�特異性T細(xì)胞雖不能阻斷最初的感染，但對SARS-CoV-2刺突蛋白保守結(jié)構(gòu)域特異性的T細(xì)胞會(huì)提供對逃避抗體中和變體的保護(hù)潛力。此外，一些新型疫苗佐劑的應(yīng)用，能夠增強(qiáng)這方面的作用。

因此，未來的疫苗設(shè)計(jì)應(yīng)含有豐富的保守和免疫原性表位庫，并排除自身抗原重疊表位，以避免疫苗誘導(dǎo)的不良反應(yīng)。同時(shí)在一些疫苗佐劑的幫助下，能夠提供增強(qiáng)的保護(hù)，徹底征服SARS-CoV-2變異給人類帶來的困擾。

參考文獻(xiàn)：

1.ImmuneEpitopes of SARS-CoV-2 Spike Protein and Considerations for Universal VaccineDevelopment. bioRxiv. 2023 Oct 27:2023.10.26.564184

       原文標(biāo)題 : SARS-CoV-2刺突蛋白的免疫表位及通用疫苗開發(fā)的考量