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引言

抗體藥物是生物技術(shù)制藥領(lǐng)域的一個重要方面�？贵w具有識別抗原的特異性，因而利用抗體診斷與治療疾病是醫(yī)藥研究者長期以來追求的目標(biāo)�？贵w與靶抗原結(jié)合具有高特異性、有效性和安全性，臨床用于惡性腫瘤、自身免疫病等各種重大疾病�？贵w藥物的發(fā)展并不是一蹴而就的，抗體的發(fā)現(xiàn)以及抗體藥物的臨床應(yīng)用經(jīng)歷了一段漫長的歷史進(jìn)程。

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一、免疫實踐的起源

抗體治療的最早應(yīng)用可以追溯到中國人接種“人痘”預(yù)防天花的記載算起，國際上一般公認(rèn)的人痘接種術(shù)最早起源于中國公元１０世紀(jì)，但據(jù)中國的一些史書記載，種痘始于唐朝。只不過當(dāng)時種痘只是在民間秘密流傳，沒有公布于世。

隨后，中國人痘接種法傳入日本、俄羅斯、土耳其，并經(jīng)由土耳其進(jìn)一步傳入歐洲。在康熙執(zhí)政后，隨著因得過天花而繼承皇位的他開始推廣人痘接種，這一技術(shù)逐漸從民間走向皇宮，得到了全國的提倡與推廣。這種技術(shù)的傳播對世界范圍內(nèi)的天花防治產(chǎn)生了重要影響。

到后來的英國人愛德華·琴納受到中國人痘接種法的啟示，接種牛痘預(yù)防天花，琴納的牛痘接種法因其安全性逐步取代人痘接種，成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的重要里程碑。

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二、抗體科學(xué)概念的萌芽

早在19世紀(jì)末，抗體被動免疫療法的創(chuàng)立為當(dāng)時不發(fā)達(dá)的疾病治療開辟了新途徑。Ehrlich提出的側(cè)鏈學(xué)說為免疫學(xué)與免疫療法奠定了基礎(chǔ)。他認(rèn)為，細(xì)胞的表面具有特異性受體分子（或稱側(cè)鏈），這些側(cè)鏈僅與毒素分子中特定的基團(tuán)結(jié)合；如果細(xì)胞與毒素結(jié)合后能存活下來，將會產(chǎn)生過量的側(cè)鏈，部分的側(cè)鏈釋放至血液中，即為抗毒素，這就是現(xiàn)在所稱的抗體。

1890年，德國生理學(xué)家 Emil von Behring 與日本微生物學(xué)家 Shibasaburo Kitasato 在研究中發(fā)現(xiàn)，暴露于白喉或破傷風(fēng)毒素的動物血清中存在一種能中和毒素的物質(zhì)（即抗體前身），將其命名為 “抗毒素”（antitoxin）。他們通過將免疫動物的血清輸注給患病動物，成功治愈感染，首次證明了血清中活性物質(zhì)的保護(hù)作用 。

 Emil von Behring 與 Shibasaburo 

1891年10月，Ehrlich在論文《免疫力的試驗性研究》中首次使用德語詞 “Antikörper”（抗體），并提出化學(xué)結(jié)構(gòu)理論：抗體與抗原的結(jié)合遵循 “鎖鑰模型”（類似酶與底物），強(qiáng)調(diào)結(jié)構(gòu)互補(bǔ)性是特異性結(jié)合的關(guān)鍵 。

Ehrlich

到現(xiàn)在，科學(xué)家們對于抗體有了一個公認(rèn)的定義�？贵w是一種由B細(xì)胞識別抗原后活化、增殖分化為漿細(xì)胞，并由漿細(xì)胞合成與分泌的、具有特殊氨基酸序列的，能夠與相應(yīng)的抗原發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白分子。

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三、抗體理論構(gòu)建階段

在抗體發(fā)現(xiàn)早期，這種特異性的抗體物質(zhì)勾起了科學(xué)家們極大的興趣，科學(xué)家們前赴后繼致力于解析抗體的結(jié)構(gòu)，但由于落后的實驗條件，進(jìn)展緩慢。直到20世紀(jì)5O年代，科學(xué)家們對抗體的結(jié)構(gòu)和抗原抗體識別機(jī)理的理解還非常淺顯。

1937年瑞典物理學(xué)家Arne Wilhelm Kaurin Tiselius通過電泳技術(shù)證明了抗體也是一種蛋白質(zhì)，并將其稱為γ球蛋白。1953年英國生物化學(xué)家Frederick Sanger成功解析了同樣身為蛋白質(zhì)的胰島素的化學(xué)結(jié)構(gòu)，從而為科學(xué)家們解析抗體結(jié)構(gòu)指明了方向。

Arne Wilhelm Kaurin Tiselius

抗體結(jié)構(gòu)的解析離不開美國生物學(xué)家Gerald Maurice Edelman，他受到Sanger解析胰島素結(jié)構(gòu)的啟發(fā)，用B-巰基乙醇處理免疫球蛋白G，分解成兩條鏈，根據(jù)分子量大小分別稱為重鏈和輕鏈，并在此基礎(chǔ)上提出了自己心目中的抗體結(jié)構(gòu)：重鏈和輕鏈折疊形成奇特的袋狀結(jié)構(gòu)，從而識別抗原。

Gerald Maurice Edelman

1963年，Edelman與RodneyRobert Porter(Sanger的第一個博士研究生)結(jié)合兩人多年的研究結(jié)果，提出了比較成熟的抗體分子模型。他們認(rèn)為，抗體是由兩條重鏈和兩條輕鏈組成的“Y”型對稱結(jié)構(gòu)，一條輕鏈和一條重鏈的一半組成了“Y”型結(jié)構(gòu)的分支�？贵w識別抗原的特異性結(jié)合位點位于“Y”型結(jié)構(gòu)的兩個分支的頂端，輕鏈和重鏈都有一部分包含其中。

1969年，Edelman和Porter完成了一項在當(dāng)時了不起的成就，他們成功對抗體1300多個氨基酸序列進(jìn)行了測定，是當(dāng)時測定氨基酸序列的最大的蛋白質(zhì)分子。隨后Edelman繼續(xù)深入研究抗體的結(jié)構(gòu)，陸續(xù)提出了越來越精確的抗體分子結(jié)構(gòu)，包括重鏈可變區(qū)、重鏈恒定區(qū)、輕鏈可變區(qū)、輕鏈恒定區(qū)以及抗體內(nèi)部二硫鍵的位置，同時他認(rèn)為抗體的差異是由可變區(qū)的差異決定的。

通過對抗體結(jié)構(gòu)的不懈研究，抗體識別抗原的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)得到了有效闡釋，卻仍無法回避抗體多樣性的基本問題。抗體的分子序列并不固定，免疫系統(tǒng)能夠產(chǎn)生不同抗體結(jié)合不同的抗原物質(zhì)。若依據(jù)“一個基因編碼一條多肽鏈”的理論，即使人類基因組都無法滿足抗體多樣性編碼的需求。對于這個問題，Edelman和另一位同行Joseph Gaily于1967年提出了一個抗體多樣性產(chǎn)生的最初的設(shè)想。他們認(rèn)為編碼抗體的基因存在染色體重排現(xiàn)象，識別抗原之后數(shù)量有限的抗體基因通過不同的組合形式編碼無限種類的抗體分子。

在Edelman提出的抗體多樣性理論的基礎(chǔ)上，1976年，日本科學(xué)家利根川進(jìn)和同事在檢測不產(chǎn)生抗體的胚胎細(xì)胞和產(chǎn)生抗體骨髓瘤細(xì)胞中抗體輕鏈基因的分布時發(fā)現(xiàn)，胚胎細(xì)胞中不同抗體基因距離較遠(yuǎn)，而骨髓瘤細(xì)胞中抗體基因距離接近，這個發(fā)現(xiàn)說明生殖細(xì)胞在發(fā)育成免疫細(xì)胞的過程中，抗體基因發(fā)生了重新分布現(xiàn)象。利根川進(jìn)在此基礎(chǔ)上用一系列確鑿的實驗數(shù)據(jù)確定了抗體多樣性是由B淋巴細(xì)胞中抗體基岡的染色體重排和突變造成的。根據(jù)估算，抗體基因通過重組和突變甚至可以編碼100億種不同的抗體，很好解釋了抗體多樣性產(chǎn)生的原因。1987年，利根川進(jìn)由于抗體多樣性的突破性研究獨享了該年度的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。

利根川進(jìn)

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四、治療性抗體的蓬勃發(fā)展

自1986年第一個治療性抗體進(jìn)入臨床以來，治療性抗體得到了迅速的發(fā)展，其已成為現(xiàn)代生物醫(yī)藥的重要組成部分。到目前為止，全球已獲批的抗體藥物多達(dá)196種, 這些抗體都至少獲得一個監(jiān)管機(jī)構(gòu)的批準(zhǔn)。伴隨現(xiàn)代科技的發(fā)展，治療性抗體經(jīng)歷了鼠源性抗體，嵌合抗體，改性抗體和表面重塑抗體（部分人源化抗體），以及全人源化抗體等不同發(fā)展階段。 

第一代：鼠源單抗（momab）

第一個單克隆抗體藥Orthoclone OKT3來自于小鼠，它的氨基酸序列都是鼠源的。鼠源抗體在給病人服用過程中常常遇到一些問題：1）人體把這些單抗藥當(dāng)作異體蛋白，會產(chǎn)生免疫排斥。2）免疫排斥使單抗藥很快從病人體內(nèi)被清除掉，大大降低了它們應(yīng)有的療效。尤其治療慢性疾病需要長期服用的情況下，鼠源單抗藥在后續(xù)注射時療效甚微；3）少數(shù)病例中，鼠源抗體會引起嚴(yán)重的過敏反應(yīng)，甚至導(dǎo)致了個別病人的死亡。因此，早期單抗藥的銷售始終沒有騰飛——Orthoclone OKT3的年銷售額僅有1千萬美元左右。因此，要想在醫(yī)學(xué)上有更廣泛的應(yīng)用，鼠源抗體必須要轉(zhuǎn)變成人源化抗體或人源抗體。

第二代：人鼠嵌合單抗（ximab）和人源化單抗（zumab）

人源化抗體一般是以鼠源抗體為基礎(chǔ)，通過更換蛋白片斷和置換部分氨基酸序列， 使抗體的最終氨基酸序列更接近人源的，其最終目的是既不引起人的免疫排斥，又不降低它對靶抗原的親和性。

抗體人源化又分為兩個層次。第一個層次是嵌合抗體（Chimeric  antibody）:  抗體的恒定區(qū)都被置換成人的氨基酸序列。嵌合單抗蛋白約33%的氨基酸序列來自小鼠，其余67%為人源的。第二個層次是人源化抗體(Humanized antibody)，即拿到針對某抗原的小鼠抗體后，只取其識別抗原的幾段區(qū)域（CDR區(qū)域），把它們移植到人源抗體中。人源化單抗中人源的序列占90%。人源化單抗顯然比嵌合單抗更有優(yōu)勢，引起免疫排斥或超敏的風(fēng)險更低。但即使這樣，由于鼠源序列的存在，人源化單抗還是不能完全避免免疫排斥或超敏的風(fēng)險。

第三代：全人源化單抗（mumab）

獲得全人源單抗主要有兩種途徑：噬菌體展示和轉(zhuǎn)基因小鼠。

噬菌體展示和轉(zhuǎn)基因小鼠在執(zhí)行過程中各有千秋。一般來說，噬菌體展示技術(shù)“先快后慢”，即找到針對某種靶蛋白的抗體很快，但選出的這個抗體和靶蛋白的親和性往往不高，需要人工細(xì)調(diào)，更換個別氨基酸。優(yōu)化這一步費時費力，而且即使優(yōu)化的抗體和通過轉(zhuǎn)基因小鼠出來的抗體相比，親和力可能還是相差一個數(shù)量級。另外，在優(yōu)化的過程中需要替換一些氨基酸，也就引進(jìn)了被免疫排斥的風(fēng)險。

轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)是“先慢后快”，將抗原注射到小鼠體內(nèi)、產(chǎn)生特異抗體、制備雜交瘤細(xì)胞等前幾步需要幾個月的時間。但一旦最初的抗體產(chǎn)生，其優(yōu)化過程在小鼠體內(nèi)繼續(xù)完成，又快又好，并且不用擔(dān)心免疫排斥的問題。

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五、抗體的篩選技術(shù)

近年來，隨著抗體藥的需求越來越大，抗體篩選技術(shù)的發(fā)展也是日新月異，目前應(yīng)用較普遍的有雜交瘤技術(shù)、抗體文庫篩選技術(shù)、B細(xì)胞克隆技術(shù)和轉(zhuǎn)基因小鼠抗體篩選技術(shù)。

雜交瘤技術(shù)

雜交瘤技術(shù)又稱為單克隆抗體技術(shù)，是在體細(xì)胞融合的技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展而來的。這項技術(shù)將免疫動物的B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，即可形成在體外長期存活并分泌免疫蛋白的雜交瘤細(xì)胞，通過克隆化可得到來自單個雜交瘤細(xì)胞的單克隆系，即雜交瘤細(xì)胞系，利用雜交瘤細(xì)胞可以大量的生產(chǎn)單克隆抗體。                           

細(xì)胞融合技術(shù)是雜交瘤技術(shù)的基礎(chǔ)，通過聚乙二醇（PEG）（最常用）、仙臺病毒、電轉(zhuǎn)等方法對細(xì)胞進(jìn)行人工誘導(dǎo)，可使兩個細(xì)胞通過膜融合形成單個細(xì)胞。融合細(xì)胞的篩選 HAT培養(yǎng)基篩選技術(shù)是雜交瘤技術(shù)中另一個關(guān)鍵的技術(shù)，在B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合后，會產(chǎn)生多種融合結(jié)果（未融合的骨髓瘤細(xì)胞、未融合的B淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞自身融合細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞自身融合細(xì)胞、正確融合的雜交瘤細(xì)胞），為了得到所需的雜交瘤細(xì)胞，必須利用 HAT 培養(yǎng)基對融合后的細(xì)胞進(jìn)行篩選。

HAT培養(yǎng)基的篩選原理為：DNA合成途徑有生物合成途徑與應(yīng)急合成途徑兩種，HAT培養(yǎng)基中含有次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）等物質(zhì)，氨基喋呤可以對 DNA的生物合成途徑進(jìn)行阻斷，骨髓瘤細(xì)胞會因為生物合成途徑被阻斷且自身缺乏應(yīng)急合成途徑導(dǎo)致不能增殖進(jìn)而快速的死亡；而B淋巴細(xì)胞因缺乏體外增殖的能力，一般在10天左右死亡；雜交瘤細(xì)胞具有體外增殖能力且由于次黃嘌呤與胸腺嘧啶核苷酸的存在，可以通過應(yīng)急途徑合成DNA并在 HAT培養(yǎng)基中正常生長，不會死亡。因此將融合后的細(xì)胞放于 HAT 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其他的融合結(jié)果會全部死亡，最終篩選出雜交瘤細(xì)胞。

噬菌體展示技術(shù)

1985年Smith GP利用基因工程，將外源基因插入絲狀噬菌體(Filamentous bacteriophage，fd)的基因組，使目的基因編碼的多肽以融合蛋白的形式展示，從而創(chuàng)建了噬菌體展示技術(shù)。

噬菌體展示技術(shù)（phage display）是將外源編碼多肽或蛋白質(zhì)的基因通過基因工程技術(shù)插入到噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當(dāng)位置，在閱讀框能正確表達(dá)，使外源多肽或蛋白在噬菌體的衣殼蛋白上形成融合蛋白，隨子代噬菌體的重新組裝呈現(xiàn)在噬菌體表面，可以保持相對的空間結(jié)構(gòu)和生物活性。然后利用靶分子，采用合適的淘洗方法，洗去未特異性結(jié)合的噬菌體。再用酸堿或者競爭的分子洗脫下結(jié)合的噬菌體，中和后的噬菌體感染大腸桿菌擴(kuò)增，經(jīng)過3-5輪的富集，逐步提高可以特異性識別靶分子的噬菌體比例，最終獲得識別靶分子的多肽或者蛋白。除了噬菌體展示技術(shù)之外，基于文庫展示的技術(shù)還包括：酵母展示技術(shù)、核糖體展示技術(shù)以及細(xì)胞展示技術(shù)等。

B細(xì)胞克隆技術(shù)

人和動物接受了外源性免疫原（如細(xì)菌、病毒、非同源蛋白等）的刺激后，獲得性免疫（Adaptive Immunity）被激活，并在 T 淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞的協(xié)同作用下，由 B 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生針對于該病原體（或免疫原）的抗體分子；B 淋巴細(xì)胞經(jīng)過一系列的成熟和分化之后，最終形成漿細(xì)胞（Plasma cell）將大量的 IgG 分泌到血液等循環(huán)系統(tǒng)中；而特定的某一個 B 淋巴細(xì)胞在經(jīng)歷了 V-D-J 重排、Class Switch 和 Somatic maturation 之后，只含有一對編碼 IgG 重鏈和輕鏈的基因。

因此，經(jīng)過 B 淋巴細(xì)胞表面標(biāo)記物和抗原特異性篩選，可以獲得針對特異性抗原的單個 B 淋巴細(xì)胞，然后通過分子生物學(xué)手段從中獲得編碼抗體 IgG 的重鏈和輕鏈基因，并在體外重組表達(dá)驗證，是目前獲得單克隆抗體最有效和快速的技術(shù)。

基于單 B 細(xì)胞篩選的抗體發(fā)現(xiàn)技術(shù)發(fā)展，還得益于流式細(xì)胞技術(shù)、微流控技術(shù)（Microfluidic）以及光流體技術(shù)（Optofluidic）等相關(guān)生物技術(shù)的發(fā)展和成熟，使其成功的從實驗室走向商業(yè)化應(yīng)用，并在單克隆抗體特別是治療性單克隆抗體的開發(fā)方面被廣泛應(yīng)用。

基于單 B 細(xì)胞分選技術(shù)的單克隆抗體開發(fā)平臺，和傳統(tǒng)的單克隆抗體開發(fā)平臺相比，最突出的優(yōu)勢在于能夠從人體內(nèi)直接篩選獲得全人源單克隆抗體；同時，也能夠大大縮短研發(fā)周期，從獲得康復(fù)病人的外周血淋巴細(xì)胞開始，一般來說在 4-6 周內(nèi)即可獲得全人源單克隆抗體，并完成相應(yīng)的生物學(xué)功能實驗（如病毒結(jié)合和中和實驗、ADCC 實驗等）；并且由于所獲得是全人源單克隆抗體，可以大大簡化甚至于不需要抗體人源化改造工程，快速推進(jìn)至臨床試驗�！　�

轉(zhuǎn)基因小鼠全人源抗體篩選技術(shù)

早在1985年，Alt等人就曾提出可以應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到具有人源序列的單克隆抗體。1989年，Bruggemann等人在小鼠中表達(dá)了人源重鏈，從而產(chǎn)生了轉(zhuǎn)基因編碼的免疫應(yīng)答。而在1994年，Lonberg和Jakobovits的團(tuán)隊分別采用了不同的方法構(gòu)建了能夠表達(dá)人源抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠。Lonberg利用了核內(nèi)顯微注射的方法，而Jakovovits用的是酵母人工染色體（YAC）的方法。重鏈包含3個重鏈可變區(qū)（VH），16個D，所有的6個JH區(qū)。

Abgenix的XenoMouse®是第一個同時有大部分人源VH和人源Vκ repertoire的轉(zhuǎn)基因小鼠品系。這些XenoMouse®小鼠有百萬堿基對大小的酵母人工染色體，在重鏈基因座，有34個有功能的VH基因，全部的DH和JH區(qū)域，作為Cμ和Cδ功能下游的人源Cγ2基因；κ輕鏈基因座含有18個Vκ基因，全部五個功能性的Jκ區(qū)，和Cκ基因。由于YAC可以整合到小鼠染色體中，這樣得到的小鼠具有較好的基因穩(wěn)定性。2005年，安進(jìn)以22億美元收購Abgenix。XenoMouse平臺上開發(fā)出的第一個單抗藥物是Abgenix和安進(jìn)共同開發(fā)的抗EGFR單抗panitumumab（于2006.9被FDA批準(zhǔn)），這也是基于轉(zhuǎn)基因小鼠的第一個全人源單抗藥物。

另一個用于產(chǎn)生全人源抗體的小鼠是GenPharm International, Inc開發(fā)的HuMab™或者叫Ultimab®。1997年，Medarex收購了該公司獲得這一技術(shù)平臺。2009年，BMS以24億美元收購Medarex，將Humab小鼠收入囊中。這一平臺可產(chǎn)生高親和力（納摩到亞納摩級別）的人源抗體。Ofatumumab是基于Ultimab平臺開發(fā)出的抗CD20單抗，它和同為CD20抗體的rituximab靶向的表位不同。Ofatumumab于2009年十月被FDA批準(zhǔn)用于治療慢性淋巴細(xì)胞白血病。Ultimab平臺還有一系列諸如Canakinumab（抗interleukin-1β的IgG1單抗，用于治療一種罕見的自身炎癥性疾病Cryopyrin蛋白相關(guān)周期性綜合征）, Ustekinumab（靶向IL-12和IL-23所共有的p40亞單位，用于18歲及以上活動性銀屑病關(guān)節(jié)炎患者的治療）等單抗產(chǎn)生。

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結(jié)語

抗體藥物從發(fā)現(xiàn)到進(jìn)入臨床應(yīng)用，經(jīng)歷了曲折而又漫長的歷程。在這段時間里，人們對于抗體藥物的認(rèn)識發(fā)生了巨大的變化。在過去的數(shù)十年里，抗體已經(jīng)成為醫(yī)藥市場上最暢銷的藥物。隨著抗體類藥物被批準(zhǔn)用于治療各種包括癌癥、自身免疫、代謝和傳染病，治療性抗體藥物的市場必會呈現(xiàn)爆炸式增長的態(tài)勢。

       原文標(biāo)題 : 抗體藥物的發(fā)展歷程