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前言

人類基因組計(jì)劃（HGP）揭示了人類基因組的大量信息，并大大增強(qiáng)了其在生物醫(yī)學(xué)研究發(fā)展中的作用。由于下一代測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，研究人員已經(jīng)能夠揭示一些遺傳因素在許多疾病中的作用，如癌癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、帕金森病和阿爾茨海默病。

此外，許多研究的成果已經(jīng)揭示了編碼和非編碼RNA（ncRNAs）的重要作用，如miRNA、長(zhǎng)ncRNAs（lncRNA）、circRNA和siRNAs。這為通過將核酸引入細(xì)胞以永久或瞬時(shí)控制改變基因的表達(dá)來(lái)開發(fā)各種疾病的可能治療方法奠定了基礎(chǔ)。此外，通過各種遞送系統(tǒng)的開發(fā)可以將RNA運(yùn)送到目標(biāo)位點(diǎn)，解決了RNA固有的不穩(wěn)定性帶來(lái)的問題。因此，許多涉及siRNA、ASO、核酶、mRNA、適配體和CRISPR／Cas的基于RNA的療法已經(jīng)開發(fā)出來(lái)，并正在各種疾病中進(jìn)行臨床試驗(yàn)�；�于RNA的藥物展現(xiàn)出卓越的應(yīng)用潛力，屬于RNA療法的時(shí)代即將到來(lái)。

SiRNA

siRNA是由核糖核酸酶Dicer通過內(nèi)切過程產(chǎn)生的，這是一種屬于RNase III家族的內(nèi)切酶，可以產(chǎn)生21－25核苷酸雙鏈RNA。一旦產(chǎn)生，Dicer將siRNA轉(zhuǎn)移到RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RISC），該復(fù)合物包含降解靶mRNA分子的Argonaute 2。由于siRNA的這種能力，它們被作為一種可能的治療方法。

SiRNA療法正在多種癌癥治療中進(jìn)行測(cè)試。siG12D－LODER是一種可生物降解的聚合物基質(zhì)，含有針對(duì)KRASG12D的siRNA，臨床研究（NCT01188785）表明，該聚合物能夠靶向腫瘤并抑制腫瘤進(jìn)展。目前，正在進(jìn)行進(jìn)一步的研究（NCT01676259），以測(cè)試siG12D－LODER與化療藥物（如吉西他濱和nab紫杉醇）聯(lián)合治療局部晚期胰腺癌患者的療效。

Polo樣激酶（PLK）參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和細(xì)胞增殖并通常在癌細(xì)胞中過表達(dá)，抑制Plk可減少癌細(xì)胞增殖。TKM－080301是一種脂質(zhì)納米顆粒（LNP）制劑，由四種脂質(zhì)和一種針對(duì)人類PLK1 mRNA的合成雙鏈siRNA組成。靜脈輸注TKM－080301顯示出良好的耐受性，但在晚期肝細(xì)胞癌患者中僅顯示出有限的抗腫瘤作用，且沒有總體生存效應(yīng)。然而，TKM－080301在腎上腺皮質(zhì)癌（ACC）中顯示出一定的腫瘤抑制作用。

蛋白激酶N3（PKN3）是磷酸肌醇－3－激酶（PI3K）途徑的下游效應(yīng)器，阻斷PKN3可以抑制腫瘤進(jìn)展和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。Atu027，一種脂質(zhì)體PKN3 siRNA制劑，在晚期實(shí)體瘤患者中安全性良好，在治療結(jié)束時(shí)，41％的受試者病情穩(wěn)定。在隨后的研究中，Atu027和吉西他濱聯(lián)合治療局部晚期或轉(zhuǎn)移性胰腺癌顯示出良好的安全性和耐受性。

除了癌癥領(lǐng)域，SiRNA在其它疾病領(lǐng)域的應(yīng)用也在積極開發(fā)。Inclisiran，是一種硫代磷酸酯、2′－O－甲基核苷酸和2′－氟核苷酸修飾的siRNA，靶向PCSK9，皮下注射已證明可降低高心血管風(fēng)險(xiǎn)患者的PCSK9水平和LDL膽固醇水平。并且僅半年注射一次，顯示出極佳的患者依從性。2020年12月11日，Inclisiran獲歐盟批準(zhǔn)上市。

許多siRNA研究針對(duì)年齡相關(guān)性黃斑變性（CNV－AMD）引起的脈絡(luò)膜新生血管，以血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體－1（VEGFR1）或RTP801為靶點(diǎn)的研究，在臨床試驗(yàn)的各個(gè)階段都顯示了有希望的結(jié)果，如AGN211745和PF－04523655。此外，QPI－1007，一種抑制caspase 2表達(dá)的siRNA，在視神經(jīng)萎縮患者中顯示出良好的耐受性和視力的改善。

此外，包括常染色體隱性遺傳原發(fā)性高草酸尿癥（PHs）、乙型肝炎病毒（HBV）和肝臟和特發(fā)性肺纖維化中，SiRNA療法均展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。

ASO

反義核酸（ASO）是18－30個(gè)堿基對(duì)的單鏈RNA／DNA分子，設(shè)計(jì)用于特異性抑制mRNA功能。它們與特定mRNA互補(bǔ)結(jié)合，通過RNase H阻礙mRNA翻譯或降解mRNA。

ASO在眼部疾病的治療，許多臨床前和臨床試驗(yàn)都顯示了有希望的結(jié)果。Leber先天性黑矇（LCA）由于包括中心體蛋白290（CEP290）在內(nèi)的各種基因的內(nèi)含子突變，導(dǎo)致視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良，引起青少年失明或嚴(yán)重視力損害。QR－110是一種單鏈、硫代磷酸化、2′O－甲基修飾的剪接調(diào)節(jié)RNA寡核苷酸，用于靶向CEP290。臨床研究（NCT03140969和NCT03913143）顯示，玻璃體內(nèi)注射QR－110可以重建LCA患者成纖維細(xì)胞中的CEP290水平，并具有良好的耐受性和安全性。

適配體

適配體是結(jié)合和抑制蛋白質(zhì)的單鏈核酸（DNA或RNA）分子。適配體形成形狀的能力提供了對(duì)目標(biāo)的高親和力和極好的特異性，由于其作用模式與抗體相似，適配子也被稱為化學(xué)抗體。目前，多種適配體已進(jìn)入各種疾病的臨床試驗(yàn)，如黃斑變性、糖尿病性黃斑水腫和慢性炎癥性疾病。

EYE001是VEGF的聚乙二醇化適配體，在體外模型中顯示出完全減少VEGF介導(dǎo)的血管滲漏、抑制視網(wǎng)膜新生血管的能力，從而改善視力。在CNV－AMD患者中進(jìn)行的EYE001單用或聯(lián)合光動(dòng)力療法的研究中顯示出明顯的視力穩(wěn)定或改善。

除了VEGF外，補(bǔ)體途徑在AMD中也起著重要作用。Zimura，一種聚乙二醇化的單鏈核酸適配體靶向補(bǔ)體因子C5以及pegcetacoplan靶向C3和C3b，它們的臨床研究表明，皮下注射能夠減少繼發(fā)于AMD的地圖樣萎縮（GA），而不會(huì)發(fā)生不良事件。

此外，ARC1779是一種靶向vWF A1結(jié)構(gòu)域的適配體，在臨床試驗(yàn)（NCT00632242）中，ARC1779顯示出良好的耐受性以及抑制血栓性血小板減少性紫癜患者vWF依賴性血小板功能的能力。Emapticap－pegol（NOX－E36）是一種靶向CCL2的適配體，在伴有蛋白尿的2型糖尿病患者中，皮下注射Emapticap顯示出良好的耐受性和抑制CCL2／CCL2受體軸的能力。

核酶

核酶是催化RNA的分子，與靶RNA雜交并導(dǎo)致RNA降解，從而抑制特定蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。重要的是，核酶可以在沒有細(xì)胞蛋白的情況下發(fā)揮作用。

RPI．4610（Angiozyme）是一種化學(xué)穩(wěn)定的抗VEGFR－1核酶，與卡鉑和紫杉醇聯(lián)合用于晚期實(shí)體瘤患者，已證明具有良好的安全性、生物利用度和腫瘤定位能力。然而，它未能在轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中證明臨床療效。

OZ1是tat－vpr特異性抗HIV核酶，通過自體CD34＋細(xì)胞遞送，在臨床試驗(yàn)（NCT00074997）中顯示CD4＋淋巴細(xì)胞顯著增加，表明細(xì)胞遞送的基因轉(zhuǎn)移在維持核酶的安全性和活性方面同樣可靠。

盡管在許多臨床試驗(yàn)中取得了成功，但也有一些研究報(bào)告表明缺乏有效性和安全性，例如胃腸道癌患者中靶向人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）編碼RNA的Ad5CRT、轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中的血管酶或嵌合核酶。因此，核酶在穩(wěn)定性、體內(nèi)活性、共定位、輸送到特定細(xì)胞以及持續(xù)穩(wěn)定和長(zhǎng)期表達(dá)方面仍需改進(jìn)。

mRNA

以mRNA為基礎(chǔ)的治療代表了一個(gè)相對(duì)新穎和高效的藥物類別。最近發(fā)表的幾項(xiàng)研究強(qiáng)調(diào)了mRNA疫苗在治療不同類型的惡性腫瘤和傳染病方面的潛在療效，這些疾病中傳統(tǒng)的疫苗策略不能引起保護(hù)性免疫反應(yīng)。

傳染病疫苗是目前mRNA療法中最領(lǐng)先的應(yīng)用。Moderma和輝瑞的新冠疫苗已經(jīng)在數(shù)十億人群中證明了安全性和有效性，展現(xiàn)出未來(lái)強(qiáng)大的應(yīng)用前景，這里不多贅述。（參閱＜mRNA疫苗在感染性疾病的研究進(jìn)展＞）

目前，針對(duì)腫瘤的mRNA疫苗有2種方式：i）使用體外負(fù)載或電穿孔的DC，ii）通過直接注射帶有或不帶有載體的mRNA。

在癌癥患者中應(yīng)用了幾項(xiàng)基于DC的mRNA疫苗的臨床試驗(yàn)，用編碼黑色素瘤相關(guān)抗原的mRNA與TriMix聯(lián)合接種導(dǎo)致晚期黑色素瘤令人印象深刻的腫瘤消退。目前mRNA疫苗正在向聯(lián)合治療方法發(fā)展，包括化療、放療和檢查點(diǎn)抑制劑。其中一些研究產(chǎn)生了持久的腫瘤生長(zhǎng)抑制。盡管這些基于DC的方法是有效的，但是它們也受限于繁瑣的程序和高昂的成本。

相比之下，直接注射裸mRNA或復(fù)合mRNA被認(rèn)為是一種快速有效的可行方法。例如，一項(xiàng)I／II期試驗(yàn)在30例轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌患者皮內(nèi)反復(fù)應(yīng)用編碼6種不同TAA（MUC1、CEA、Her2／neu、telomerase、survivin、MAGE－A1）的mRNA疫苗。10年后的長(zhǎng)期結(jié)果表明，mRNA疫苗是安全有效的。它延緩了腫瘤生長(zhǎng)并提高了生存率，這與檢測(cè)到的針對(duì)TAAs的免疫反應(yīng)密切相關(guān)。

另一項(xiàng)研究中，7名局部晚期患者和39名轉(zhuǎn)移性NSCLC患者接受了5次皮內(nèi)注射CV9201，這是一種編碼5種NSCLC抗原（NY－ESO－1、MAGE－C1／2、survivin、5T4）的活性疫苗。63％的患者產(chǎn)生了針對(duì)至少一種抗原的抗原特異性免疫應(yīng)答，60％的患者表現(xiàn)出激活的IgD＋CD38high B細(xì)胞增多。31％的患者疾病穩(wěn)定（SD），另外三分之二的患者病情進(jìn)展。一項(xiàng)旨在提高抗腫瘤免疫力的類似研究檢測(cè)了晚期NSCLC患者接種CV9202聯(lián)合局部放療的情況。

CV9202是一種基于RNA的活性疫苗，編碼6種NSCLC TAA（NY－ESO－1、MAGE－C1、MAGE－C2、5T4、survivin和MUC－1）。與基線相比，大多數(shù)患者的抗原特異性細(xì)胞免疫和體液免疫增強(qiáng)。一名接受疫苗、放療和化療的患者出現(xiàn)部分緩解（PR），46．2％的患者獲得SD。

mRNA－4157疫苗是美國(guó)Moderna公司研發(fā)的一款mRNA疫苗，它是一種針對(duì)每位腫瘤患者量身定制的個(gè)體化腫瘤疫苗，目前mRNA－4157癌癥疫苗能夠容納高達(dá)34個(gè)編碼新抗原的mRNA序列。在mRNA－4157聯(lián)合Keytruda的I期臨床試驗(yàn)中，13例接受單藥治療的患者中有11名患者保持疾病穩(wěn)定。在聯(lián)合治療組中，20例患者中有6例獲得響應(yīng)，其中包括1例完全緩解和5例部分緩解。6名患者疾病穩(wěn)定，8名病情惡化。與mRNA－4157相關(guān)的所有不良事件都是可逆的，并且是輕微的。沒有觀察到與治療有關(guān)的≥3級(jí)不良事件，證明了疫苗的安全性和耐受性。目前，有多項(xiàng)腫瘤mRNA疫苗處于臨床招募階段。

CRISPR／Cas9

CRISPR－ Cas9系統(tǒng)是一種細(xì)菌防御機(jī)制，利用引導(dǎo)RNA（gRNA）介導(dǎo)DNA內(nèi)切酶Cas9在靶DNA中引入位點(diǎn)特異性斷裂。這種DNA編輯能力使得CRISPR－Cas9通過合成sgRNA在基因組修飾中用作RNA治療劑，用于生物和治療應(yīng)用。

許多研究表明CRISPR／Cas9可用于治療遺傳性疾病，如囊性纖維化（CF）、杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥（DMD）、血紅蛋白病以及HIV和β－地中海貧血。在一項(xiàng)研究中，CRISPR／Cas9能夠增加肌管中的utrophin數(shù)量并去除重復(fù)的DMD外顯子18–30，從而在DMD中產(chǎn)生全長(zhǎng)dystrophin。

在β－地中海貧血中，人類血紅蛋白β（HBB）基因的突變可以通過CRISPR／Cas9糾正。通過piggyBac轉(zhuǎn)座子，患者來(lái)源的IPSC中的CRISPR／Cas9有效地糾正了HBB突變，而不影響IPSC的多能性，并在分化為紅細(xì)胞時(shí)恢復(fù)了HBB的表達(dá)。此外，CRISPR－Cas9的類似應(yīng)用也已在艾滋病等免疫疾病中得到證實(shí)。

盡管這些研究為未來(lái)的CRISPR－Cas9臨床試驗(yàn)提供了基礎(chǔ)，但在CRISPR／Cas9進(jìn)一步應(yīng)用于臨床試驗(yàn)和隨后的治療之前，仍有一些挑戰(zhàn)有待解決。包括向靶細(xì)胞遞送基因編輯工具可能的靶外效應(yīng)。此外，在將CRISPR－Cas9轉(zhuǎn)化為治療應(yīng)用之前，還需要考慮CRISPR－Cas9的倫理問題和種系應(yīng)用。

小結(jié)

近年來(lái)，以RNA為基礎(chǔ)的療法逐漸成為各種疾病的潛在干預(yù)策略。一般來(lái)說(shuō)，RNA療法根據(jù)其作用方式和使用的分子分為不同的類別。許多RNA療法已被開發(fā)用于各種疾病，并且在許多臨床前和臨床研究中獲得非常有希望的結(jié)果，尤其是mRNA疫苗成為目前最火熱的研究領(lǐng)域之一。目前，基于RNA的療法依然存在許多障礙，包括遞送系統(tǒng)在內(nèi)的許多方面仍需要得到進(jìn)一步的研究和開發(fā)，然而不可否認(rèn)，未來(lái)十年屬于RNA治療的時(shí)代終將到來(lái)。

參考文獻(xiàn)：

1．RNA Therapeutics － Researchand Clinical Advancements． Front Mol Biosci． 2021； 8： 710738．

2． mRNA vaccines for infectious diseases： principles， delivery and clinical translation． Nat RevDrugDiscov． 2021 Aug 25 ： 1–22．

3． Clinical and immunological effects of mRNA vaccines inmalignant diseases． Mol Cancer． 2021 Mar 15；20（1）：52．

       原文標(biāo)題 : 窺視未來(lái)：屬于RNA療法的時(shí)代