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引言

在過去十年中，我們在提高CAR-T細(xì)胞療法的療效方面取得了顯著進(jìn)展。然而，其臨床益處仍然有限，尤其是在實(shí)體腫瘤中。即使在血液腫瘤中，由于多種因素，包括T細(xì)胞擴(kuò)增不良和過繼轉(zhuǎn)移后缺乏長期持續(xù)性，對CAR-T療法有反應(yīng)的患者仍有復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。這一問題在實(shí)體瘤中更為明顯，因?yàn)槟[瘤微環(huán)境對T細(xì)胞的存活、浸潤和活性有負(fù)面影響。事實(shí)上，癌癥的標(biāo)志之一就是TME中過多的抑制性決定因素導(dǎo)致T細(xì)胞功能受損，從而導(dǎo)致T細(xì)胞耗竭。

有限的持久性仍然是CAR-T療法發(fā)展的一個(gè)重大障礙，這是從細(xì)胞制造步驟開始就遇到的問題。包括CAR的設(shè)計(jì)和體外操作以及培養(yǎng)條件，可能在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此，工程化CAR-T細(xì)胞以提高其存活率并逆轉(zhuǎn)或防止耗竭表型可能是一種合乎邏輯的治療方法�，F(xiàn)代合成生物學(xué)和基因組編輯技術(shù)提供了機(jī)會(huì)，迄今為止，一些研究已經(jīng)采取了一些限制和創(chuàng)造抗耗竭T細(xì)胞的方法，并在幾個(gè)關(guān)鍵的臨床試驗(yàn)中進(jìn)行了測試。這些方法可能改善CAR-T細(xì)胞的持久性問題，為患者帶來希望。

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一、影響CAR-T細(xì)胞持久性的因素

CAR的設(shè)計(jì)

細(xì)胞外CAR結(jié)構(gòu)域的類型、連接單鏈抗體與跨膜結(jié)構(gòu)域的間隔區(qū)類型以及構(gòu)成CAR的共刺激結(jié)構(gòu)域已被證明對T細(xì)胞功能和持久性有深遠(yuǎn)影響。

臨床試驗(yàn)中使用的大多數(shù)CAR來源于小鼠，這可能導(dǎo)致體液和CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致免疫排斥。將含有小鼠成分的CAR-T細(xì)胞重新輸入到首次治療后出現(xiàn)CD19+復(fù)發(fā)的患者中基本上是無效的。此外，細(xì)胞表面的小鼠CAR受體簇可產(chǎn)生強(qiáng)直信號，導(dǎo)致T細(xì)胞耗竭。2016年，帶有人源化scFv的CAR-T進(jìn)入臨床試驗(yàn)，人源化CAR顯示出與小鼠CAR相似的細(xì)胞毒性活性，但是由于較低的免疫原性而增強(qiáng)了持久性。

CAR的親和力影響強(qiáng)直信號，對靶細(xì)胞過強(qiáng)的親和力可能導(dǎo)致T細(xì)胞耗竭。一項(xiàng)研究開發(fā)了一種CAT-CAR（CD19單鏈抗體），其與CD19的親和力比從傳統(tǒng)的CAR低40倍。該結(jié)構(gòu)在復(fù)發(fā)或難治性兒童BLL患者中進(jìn)行了測試，臨床研究發(fā)現(xiàn)，14例CAR-T細(xì)胞擴(kuò)增增加的患者中有11例表現(xiàn)出持續(xù)性。

此外，共刺激域在CAR-T細(xì)胞的持久性和有效性中也起著關(guān)鍵作用，共刺激分子包括CD28、ICOS、CD27、4-1BB、OX40和CD40L。幾項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，配備4-1BB結(jié)構(gòu)域而非CD28結(jié)構(gòu)域的CAR結(jié)構(gòu)中的T細(xì)胞持久性增強(qiáng)。其他研究報(bào)告，含有4-1BB的CAR-T細(xì)胞顯示出增強(qiáng)的記憶T細(xì)胞（TEM）表型，這可能延遲CAR-T細(xì)胞耗竭。ICOS屬于CD28共刺激分子家族，研究證明，CAR結(jié)構(gòu)中ICOS和4-1BB共刺激結(jié)構(gòu)域的組合顯著增加T細(xì)胞的持久性。

盡管存在相互矛盾的證據(jù)，但人們認(rèn)識到CD28-CAR與高效應(yīng)器功能和有限的T細(xì)胞持久性相關(guān)，而4-1BB-CAR和ICOS-CAR的效力較低，但持續(xù)時(shí)間較長。因此，這些觀察結(jié)果表明，共刺激域的結(jié)構(gòu)是影響CAR-T細(xì)胞持久性的重要因素。

體外操作和淋巴清除

制造T細(xì)胞的過程需要從患者身上獲取足夠數(shù)量的健康T細(xì)胞。然而，經(jīng)過化療治療，尤其是那些含有氯法拉濱或阿霉素的化療，導(dǎo)致淋巴細(xì)胞減少會(huì)使最終的CAR-T細(xì)胞質(zhì)量不理想，用于輸注的T細(xì)胞類型嚴(yán)重影響治療的效果。

事實(shí)上，通過使CD4/CD8比率正常化或使用幼稚或記憶細(xì)胞亞群，在臨床前模型中獲得了更好的持久性。幾項(xiàng)研究表明，使用早期譜系細(xì)胞富集的T細(xì)胞群能夠更好地?cái)U(kuò)增，并提高CAR-T細(xì)胞治療的持久性和療效。此外，多項(xiàng)研究表明，在制造過程中向細(xì)胞培養(yǎng)物中添加抗氧化劑，如N-乙酰半胱氨酸，也可抑制效應(yīng)器分化并促進(jìn)TSCM細(xì)胞的擴(kuò)增。

在CAR T細(xì)胞輸注的前幾天，患者接受一種淋巴清除的化療方案，最常見的是環(huán)磷酰胺（cy）、氟達(dá)拉濱（flu）和苯達(dá)莫司汀（ben）。淋巴清除療法根除調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）和其他免疫抑制細(xì)胞，增加CAR-T細(xì)胞的擴(kuò)增并延長其持續(xù)性。正如在成人B-ALL和B-NHL臨床試驗(yàn)中觀察到的那樣，充分的淋巴清除對治療成功至關(guān)重要，并可能防止CAR的排斥反應(yīng)。

T細(xì)胞耗竭

在TME中，髓源性抑制細(xì)胞（MDSC）、癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAF）和腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的免疫抑制細(xì)胞因子的存在會(huì)導(dǎo)致T細(xì)胞耗竭。

慢性暴露于抗原也可導(dǎo)致T細(xì)胞衰竭，如果抗原刺激持續(xù)存在，T細(xì)胞會(huì)發(fā)生一系列表觀遺傳、代謝和轉(zhuǎn)錄改變，出現(xiàn)耗竭狀態(tài)的表征。這種過程以遞進(jìn)的方式發(fā)生，IL-2和TNF-α在早期丟失，IFN-γ和趨化因子分泌在耗竭進(jìn)展后期減少。盡管高增殖能力也在早期喪失，但在體內(nèi)受到刺激時(shí)，耗竭的T細(xì)胞仍能有限增殖。

耗竭的細(xì)胞也表現(xiàn)出抑制性受體的高表達(dá)，如PD-1、TIM-3、LAG-3、CD160、BTLA、CTLA-4和TIGIT。

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二、提高CAR-T細(xì)胞持久性和效力的策略

表達(dá)細(xì)胞因子及其受體

第四代CAR T細(xì)胞最近被開發(fā)出來，用于抵抗TME中的免疫抑制環(huán)境，同時(shí)克服免疫耗竭。TRUMKS設(shè)計(jì)將CAR-T細(xì)胞的細(xì)胞毒性功能與具有免疫調(diào)節(jié)能力的細(xì)胞因子的原位遞送結(jié)合起來。在誘導(dǎo)系統(tǒng)的作用下，在CAR結(jié)合抗原后，細(xì)胞因子被合成，并以自分泌方式發(fā)揮作用，以增加T細(xì)胞的存活和擴(kuò)增。細(xì)胞因子也可以旁分泌方式發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)周圍環(huán)境，干擾TME中存在的免疫抑制細(xì)胞因子。包括IL-12、IL-7、IL-15、IL-18、IL-21和IL-23在內(nèi)的一系列細(xì)胞因子目前正在研究中，并已進(jìn)入早期臨床試驗(yàn)階段。

IL-12是一種促炎癥細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)Th1CD4+T細(xì)胞反應(yīng)，促進(jìn)CD8+克隆擴(kuò)增和持續(xù)存在。它還負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)CTL和自然殺傷（NK）細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性，重新激活無能的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞，招募NK細(xì)胞，并抑制Treg。對結(jié)構(gòu)性表達(dá)IL-12的CD19-CAR-T細(xì)胞的臨床前研究表明，它增強(qiáng)了腫瘤殺傷效果和針對癌癥抗原的免疫記憶。然而，與IL-12相關(guān)的潛在致命毒性使得有必要開發(fā)一種誘導(dǎo)系統(tǒng)，僅在CAR激活時(shí)限制IL-12的分泌。一些臨床研究（NCT02498912、NCT03932565和NCT03542799）正在進(jìn)行和招募中。

IL-15是一種刺激CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞活化、增殖和細(xì)胞毒性活性的細(xì)胞因子。IL-18增加Th1細(xì)胞細(xì)胞因子的產(chǎn)生，同時(shí)抑制IL-10的合成。IL-15和IL-18都是免疫反應(yīng)的增強(qiáng)劑，已經(jīng)在CAR-T細(xì)胞上進(jìn)行了測試。與傳統(tǒng)的CAR-T細(xì)胞相比，分泌IL-18和IL-15的CAR-T細(xì)胞在荷瘤小鼠中顯示出增強(qiáng)的擴(kuò)張性和持久性，并且在體外和體內(nèi)顯示出增強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞毒性。目前正在招募多項(xiàng)臨床試驗(yàn)，使用工程化T細(xì)胞和NK細(xì)胞測試IL-15和IL-18分泌的CAR在實(shí)體瘤和血液瘤中的作用。

最近的研究表明，在同一個(gè)CAR-T細(xì)胞中共同表達(dá)多種細(xì)胞因子是可能的。CT04833504是最近完成的一項(xiàng)臨床試驗(yàn)，其中在復(fù)發(fā)或難治性B細(xì)胞淋巴瘤患者中檢測表達(dá)IL-7和CCL19的CD19+CART細(xì)胞，但結(jié)果尚未報(bào)道。目前正在招募另外兩項(xiàng)臨床試驗(yàn)，以檢測表達(dá)IL-7的CAR-T細(xì)胞與PD-1阻斷劑或其他細(xì)胞因子的分泌相結(jié)合。

聯(lián)合檢查點(diǎn)阻斷療法

通過抑制檢查點(diǎn)信號減少耗竭的策略包括通過shRNA表達(dá)載體或CRISPR/Cas9敲除共抑制分子。許多研究報(bào)告，阻斷檢查點(diǎn)抑制可恢復(fù)細(xì)胞因子的產(chǎn)生并促進(jìn)CAR-T細(xì)胞存活。此外，同時(shí)阻斷多個(gè)免疫檢查點(diǎn)，如PD-1、TIM-3和LAG-3，可協(xié)同增加CAR-T細(xì)胞的效應(yīng)器功能。

將CAR-T細(xì)胞與免疫檢查點(diǎn)阻斷療法相結(jié)合可能是增強(qiáng)抗腫瘤活性、持久性和記憶細(xì)胞形成的有效策略。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和乳腺癌細(xì)胞系中，抗PD-1抗體增強(qiáng)了抗HER2 CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤活性。然而，一些臨床試驗(yàn)報(bào)告，在使用PD-1抑制劑和抗GD2 CAR-T細(xì)胞聯(lián)合治療神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者后，結(jié)果為陰性。

此外，一些研究已經(jīng)采用其他策略來阻斷PD-1，例如基因編輯以使CAR-T細(xì)胞分泌PD-1阻斷抗體或下調(diào)PD-1。

使用干性T細(xì)胞

效應(yīng)T細(xì)胞最初被認(rèn)為是ACT的最佳產(chǎn)品，因?yàn)樗鼈兙哂袣⑺滥[瘤細(xì)胞的功效。然而，它們的持久性有限，并且擴(kuò)增能力很差，很容易發(fā)生耗竭。

TSCM由于其壽命長、自我更新能力強(qiáng)以及在不同T細(xì)胞群中的分化能力，是ACT的理想候選。臨床研究表明，輸注表型和功能性TSCM樣CAR-T細(xì)胞（CD62L+、CD28+和CD27+）可產(chǎn)生良好的結(jié)果。例如，使用抗CD-19 CAR-T細(xì)胞治療的CLL和多發(fā)性骨髓瘤患者顯示出與CD27+CD45RO−CD8細(xì)胞群相關(guān)的良好反應(yīng)。此外，對小鼠的研究表明，注入富含CD62L+的T細(xì)胞群可增加擴(kuò)增和持久性，從而導(dǎo)致持久的腫瘤消退。

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結(jié)語

盡管在過去十年中CAR-T細(xì)胞治療取得了顯著進(jìn)展，然而CAR-T細(xì)胞在患者體內(nèi)的有限持久性依然是一個(gè)挑戰(zhàn)，主要原因是T細(xì)胞耗竭。通過對CAR結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，改變生產(chǎn)條件，或引入新的治療方法，我們可能創(chuàng)造抗耗竭的工程化T細(xì)胞，從而進(jìn)一步擴(kuò)大CAR-T細(xì)胞的臨床應(yīng)用。盡管迄今為止的結(jié)果仍然有限，但可能性是無窮的，突破可能即將到來。

參考文獻(xiàn)：

1.Improving CAR T-Cell Persistence. Int J MolSci. 2021 Oct; 22(19): 10828.

       原文標(biāo)題 : 影響CAR-T細(xì)胞持久性的因素