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前言

以嵌合抗原受體（CARs）為基礎的T細胞治療已顯示出對血癌的巨大成功；然而，潛在的致命毒性（如細胞因子釋放綜合征）和高成本是限制CAR－T細胞臨床應用的一些缺點，有待克服。

自然殺傷（NK）細胞是當前免疫學研究的焦點，迄今為止，利用NK細胞治療惡性腫瘤已經(jīng)取得了一定的成功。NK細胞受體生物學的最新進展極大地改變了我們對NK細胞如何識別和殺死腫瘤細胞的理解。CAR－NK細胞由于其獨特的識別機制、強大的細胞毒性作用以及臨床安全性，成為癌癥再靶向治療的強力候選。此外，NK細胞降低了同種異體反應的風險，可以作為“現(xiàn)成產(chǎn)品”。

雖然目前如火如荼的CAR－NK療法依然面臨著許多挑戰(zhàn)和障礙，但其巨大的潛力已經(jīng)在腫瘤免疫治療領域展現(xiàn)出廣闊的前景。

NK細胞生物學

NK細胞是第一個被鑒定的先天性淋巴細胞（ILC）亞型，能對病毒感染和／或轉化的細胞產(chǎn)生多種效應器功能，主要是細胞殺傷和產(chǎn)生促炎細胞因子。NK細胞和其他ILC家族成員（ILC1s、ILC2s和ILC3s）與B細胞和T細胞來源于相同的淋巴祖細胞。NK細胞的細胞毒性活性使它們在功能上與CD8＋T細胞最為相似，而ILC1、ILC2和ILC3群體的細胞因子生成模式將這些細胞分別對應CD4＋T細胞的TH1、TH2和TH17亞群。

NK細胞的兩個最典型的亞群是CD56brightCD16－和CD56dimCD16＋群體。CD56bright細胞在外周血中的數(shù)量較少（循環(huán)中90％的NK細胞是CD56dim），而組織中的NK細胞主要是CD56bright。CD56bright NK細胞是強有力的細胞因子產(chǎn)生者，除非受到促炎性細胞因子如IL－15的刺激，否則細胞毒性較弱。相比之下，CD56dim NK細胞群可介導感染細胞和惡性細胞的連續(xù)殺傷，主要通過包含顆粒酶B和穿孔素的預先組裝的溶細胞顆粒在免疫突觸中的胞吐，最終誘導靶細胞凋亡。

NK細胞的激活和抑制性受體

與B細胞和T細胞不同，NK細胞不表達體細胞重排的抗原受體，而是激活受體和抑制受體的隨機組合。通過這些不同受體的刺激信號與抑制信號的平衡產(chǎn)生對靶細胞的反應或耐受。MHC－I（主要組織相容性復合物Ⅰ類）抗原特異性的抑制性受體可密切調節(jié)NK細胞介導的細胞毒性和淋巴因子的產(chǎn)生。MHC－I特異性受體的抑制信號對于造血細胞避免NK細胞的破壞至關重要。這個概念被稱為“丟失自我”，最初是由 Ljunggren和Karre 提出的。這種MHC－I識別抑制性受體形成了NK細胞表面受體的三個家族，即KIRs（殺傷細胞免疫球蛋白樣受體）、LIRs（白細胞免疫球蛋白樣受體）和NKG2A（自然殺傷細胞2族A）。

KIRs是免疫球蛋白超家族的成員，是識別經(jīng)典人類白細胞抗原A、B和C（HLA－Ia類）的I型跨膜分子。LIRs又稱ILTs（免疫球蛋白樣轉錄物），形成第二組受體，除了HLA Ia類外，主要識別非經(jīng)典HLA－G（Ib類）分子。LIRs與KIRs屬于同一個Ig超家族。NKG2A是NKG2族的一個成員，包括A、B、C、D、E、F和H，與CD94二聚形成NKG2A／CD94受體。它屬于受體的C型凝集素家族，識別非經(jīng)典HLA－EⅠ類分子作為其配體。

NK細胞的殺傷作用不僅需要通過抑制性受體檢測轉化細胞上的MHC－I分子，還需要通過激活性受體激活NK細胞。自然細胞毒性受體（NCR）是一組自然殺傷細胞表面激活性受體，包括NKp46、NKp30和NKp44。這些受體以及NKG2D和DNAM－1（DNAX輔助分子－1）識別病毒感染或惡性轉化細胞表面表達的配體。一些共受體（2B4、NKp80、NTB－A和CD59）也被表達，它們只有與其他激活性受體結合才能發(fā)揮作用。CD16（或FcγRIII）也是一種激活性受體，主要由CD56dim NK細胞亞群表達，對IgG包被靶細胞的抗體依賴性細胞毒性（ADCC）至關重要。

CAR－T和CAR－NK

CAR－NK細胞和CAR－T細胞一樣存在胞外、跨膜和胞內(nèi)信號傳導域。NK細胞通過另外兩個共刺激分子，即NKG2D和CD244（2B4）增加其細胞毒性能力和細胞因子的產(chǎn)生。因此，比CAR－T細胞具有更強的腫瘤特異性靶向性和細胞毒性。CAR－NK細胞療法可能在未來成為CAR－T療法的替代方案，因為CAR－NK細胞具有以下超越CAR－T的幾個獨特特征。

首先，異基因NK細胞對于過繼性細胞治療（ACT）是相當安全的，因為它們通常不介導發(fā)生GVHD。此外，NK細胞僅分泌少量IFN－γ和GM－CSF，不產(chǎn)生啟動CRS的IL－1和IL－6。其次，除了通過單鏈抗體識別腫瘤表面抗原來抑制癌細胞外，NK細胞還可以通過多種受體識別各種配體來抑制癌細胞，例如自然細胞毒性受體（NKp46、NKp44和NKp30）、NKG2D和DNAM－1（CD226）。最后，NK細胞在臨床樣本中非常豐富，可以從外周血（PB）、臍帶血（UCB）、人類胚胎干細胞（HESC）、誘導多能干細胞（IPSC）甚至NK－92細胞系中產(chǎn)生。

CAR－NK細胞療法的臨床研究

CAR－NK療法的研究目前處于起步階段，臨床研究的數(shù)量逐年增加。此外，在研究的靶標方面，CD19抗原在血液腫瘤中最常見。在實體瘤中進展最為廣泛的CAR－NK療法包括腫瘤相關抗原HER2、MUC1和PMSA等靶點。

目前，一些正在進行的臨床試驗正在調查CAR－NK細胞治療血液學腫瘤和實體瘤的安全性和有效性，這些試驗在下表列出。

CAR－NK細胞治療的挑戰(zhàn)

低持久性

在缺乏細胞因子支持的情況下，輸注細胞缺乏體內(nèi)持久性是過繼NK細胞治療的主要缺點之一。雖然它可能更安全的，但它也會限制NK細胞免疫治療的效果。外源性細胞因子已被證明能增加過繼性NK細胞的增殖和耐久性；然而，它們也可能導致不希望的副作用，包括抑制性免疫亞群的生長，如Tregs。

轉移到所需的腫瘤部位

快速歸巢到腫瘤床對于過繼性細胞治療效果至關重要，并且受NK細胞和腫瘤細胞釋放的趨化因子之間復雜相互作用的控制。然而，NK細胞歸巢到腫瘤部位的效率一直存在爭議，因此促使人們不斷努力去進行改進。

一些研究人員已經(jīng)研究了各種工程方法來改善NK細胞歸巢。例如，用編碼趨化因子受體CCR7的mRNA電穿孔NK細胞，以增加向表達趨化因子CCL19的淋巴結的移動。用編碼CXCR2的病毒載體轉導的NK細胞對表達同源配體如CXCL1、CXCL2、CXCL5、CXCL6和CXCL8的腎細胞癌腫瘤表現(xiàn)出更好的運動性。為了提高實體瘤患者NK細胞免疫治療的成功率，在小鼠模型中研究了幾種促進NK細胞向腫瘤部位轉運的新技術；然而，這些方法的有效性還需要在臨床試驗中進行驗證。

免疫抑制腫瘤微環(huán)境

TME包括免疫抑制分子、免疫抑制細胞和妨礙免疫細胞功能的不利環(huán)境，是CAR－NK細胞治療的主要障礙。TGF－β；腺苷；吲哚胺2，3－雙加氧酶（IDO）和前列腺素E2（PGE2）是TME中發(fā)現(xiàn)的可損害NK細胞活性的免疫抑制細胞因子和代謝物。Treg細胞；調節(jié)性B細胞；髓源性抑制細胞；腫瘤相關巨噬細胞（TAM）；血小板；成纖維細胞和一些不利的代謝因素，如缺氧、酸度和營養(yǎng)缺乏，在惡性環(huán)境中會導致免疫抑制。

因此，研究人員正致力于開發(fā)能夠防止某些免疫抑制作用的CAR－NK細胞。例如，通過使用CRISPR／Cas9技術敲除TGF－βR2基因或者阻斷NK細胞上的高親和力A2A腺苷受體。TME導致NK細胞耗竭的另一個重要方法是免疫檢查點分子。為了克服這個問題，基因組編輯被用來消除NK細胞的檢查點成分，以改善其功能。

慢病毒低轉導效率

基于慢病毒的轉導系統(tǒng)是細胞內(nèi)基因修飾和傳遞的最常用的方法之一。然而，由于自然特性，NK細胞對慢病毒具有抗性，這使得基于慢病毒的轉導成為一個挑戰(zhàn)。為了改進病毒轉導，人們使用了各種化學物質，例如，可以使用魚精蛋白硫酸鹽或葡聚糖去除細胞膜上的電荷。

CAR－NK細胞療法的未來展望

識別靶抗原

CARs設計中最關鍵的一步是識別高度一致表達的靶腫瘤抗原。大多數(shù)腫瘤相關抗原（TAAs）也由一些健康細胞表達，因此，不可避免帶來“靶向非腫瘤”的效應。此外，同一腫瘤的單細胞克隆中這些TAA的表達可能存在巨大差異。為了克服這個問題，人們設計了雙特異性CAR，可以同時靶向多個抗原。

這可以通過多種方式實現(xiàn)，例如，可以同時注射針對不同抗原的不同CAR－NK細胞；或者設計一種能夠識別多種抗原的CAR，這一目標可以通過“串聯(lián)CAR”實現(xiàn)，其中兩個結合點連接到單個分子上，以提高免疫突觸的效率。此外，通過使用一個稱為“雙順反子CAR”的載體可以在同一免疫細胞上產(chǎn)生多個CAR。

提高NK細胞活性

幾個免疫檢查點調節(jié)和抑制NK細胞活性。這些免疫檢查點起到了“天然剎車”的作用，以防止自身免疫疾病或過度激活引起的免疫病理狀況。這些檢查點的基因缺失或阻斷可以幫助CAR－NK細胞保持過度活躍，更快地擺脫癌癥和轉移。

例如，一種新的NK－92細胞系被設計成靶向PD－L1、ER保留的IL－2和高親和力CD16的CAR，稱為PD－L1靶向haNK（t－h(huán)aNK）。令人興奮的臨床前數(shù)據(jù)表明，這些細胞在體外對15種腫瘤細胞株具有特異的抗腫瘤作用，在體內(nèi)對三陰性乳腺癌、膀胱腫瘤和肺癌具有很強的抗腫瘤作用。

另一個提高CAR－NK細胞活性的重要策略是腫瘤代謝的調節(jié)，但這一策略尚未得到應有的重視。在缺氧條件下，腺苷是通過CD39和CD73代謝ATP產(chǎn)生的，它們參與免疫逃避，阻止NK細胞運輸?shù)侥[瘤部位，并阻止NK細胞成熟。NKG2D工程化的CAR－NK細胞在抗CD73抗體抑制后顯示出治療肺癌的良好效果。

克服免疫抑制微環(huán)境

腫瘤具有多種免疫抑制因子，如TGF－β、IL－10、PD－1或精氨酸酶。有幾種方法可以降低TGF－β的抑制作用。例如，TGF－β激酶抑制劑和NK細胞的組合被發(fā)現(xiàn)可以恢復NK細胞的細胞毒性，并且保留NKG2D和CD16的表達。此外，使用帶有細胞外TGF－β受體結構域的混合型CARs已被發(fā)現(xiàn)在提高NK－92細胞的抗腫瘤潛能方面相當成功。通過敲除實體瘤中的SMAD3，NK細胞的細胞毒性活性已得到增強。

提高安全性

提高基于CAR－NK細胞治療安全性的重要方法可能包括通過加入自殺基因或開發(fā)雙特異性CAR分子來修飾CAR結構，以更好地靶向腫瘤特異性抗原。

CAR－NK細胞可以以CAR依賴和CAR非依賴的方式同樣靶向腫瘤；因此，NK細胞的這一特性可以被用來發(fā)揮增強的腫瘤殺傷作用和開發(fā)非信號CAR。這些非信號CAR缺乏直接殺傷信號，但通過促進NK細胞在靶細胞上的駐留和粘附，可以增強NK細胞的特異性殺傷。另一個有趣的策略是設計能夠調節(jié)TME的CAR－NK，這種CAR－NK被命名為“裝甲”CAR－NK細胞。這些非常特殊的CAR－NK細胞表達幾種外源基因，可以調節(jié)局部TME以防止任何有害影響。

提高可及性

為了克服實體瘤中CAR－NK細胞的可及性，可以使用幾種方法，包括局部給藥、腹腔給藥和聚焦超聲引導給藥。例如，在模擬人類胸膜惡性腫瘤的原位模型中發(fā)現(xiàn)胸膜注射非常有效，其功能持續(xù)時間甚至比靜脈注射獲得的時間更長。局部給予CAR免疫細胞也可能有助于減少治療劑量。

小結

總的來說，NK細胞免疫生物學領域的進展和進步為更好和更新穎的免疫療法奠定了基礎，NK細胞優(yōu)秀的抗腫瘤作用使其成為細胞免疫治療的焦點。CAR－NK細胞療法是一個很有前途的臨床研究領域，與CAR－T細胞相比，CAR－NK細胞具有自己獨特的優(yōu)點，但仍面臨著一些挑戰(zhàn)。這些挑戰(zhàn)包括細胞的持久性，克服免疫抑制微環(huán)境，以及轉導效率等。相信解決好這些問題，基于NK細胞優(yōu)秀的抗腫瘤血統(tǒng)，極有可能在CAR修飾的武裝下為腫瘤治療帶來新的突破。

       原文標題 : 細數(shù)CAR-NK：從生物學到未來展望